ripply1在斑馬魚早期胚胎背腹發育中的作用

孟亞平，劉春業，石德利*

（1.山東大學生命科學學院，濟南 250100；2.清華大學生命科學學院，北京 100084）

研究報告

ripply1在斑馬魚早期胚胎背腹發育中的作用

孟亞平1，2，劉春業1，石德利1*

（1.山東大學生命科學學院，濟南 250100；2.清華大學生命科學學院，北京 100084）

目的探究ripply1基因在斑馬魚早期背腹軸發生過程中的作用。方法利用斑馬魚整封原位雜交技術揭示ripply1基因在斑馬魚早期胚胎發育過程中的表達模式，通過顯微注射技術在胚胎1細胞期注射ripply1的mRNA來高表達Ripply1蛋白并在后期觀察胚胎背腹標記基因的變化及胚胎形態變化。利用Tol2轉基因技術構建ripply1啟動子驅動的GFP轉基因魚。結果原位雜交結果顯示ripply1基因在斑馬魚原腸早期胚盾期特異表達在胚盾處，即預定的背部。高表達ripply1后，在胚盾期背部標記基因表達范圍擴大，腹部標記基因表達減弱，受精后24小時胚胎表現出嚴重的背部化表型：頭部增大，腹部卵黃延伸減弱，尾部軀干及尾部區域減少，有的甚至形成了第二個體軸。得到的轉基因魚揭示ripply1母源表達，并且轉錄起始位點上游1200個堿基驅動的GFP能模擬內源基因的表達圖式。結論ripply1可能參與斑馬魚胚胎早期背腹軸的發生。

斑馬魚；ripply1；早期胚胎發育；背腹發生

胚軸（embryonic axes）形成是多細胞生物軀體模式（body plan）建立的一個重要過程，主要包括前ˉ后軸（anterior-posterior axis）、背 ˉ腹軸（dorsalventral axis）和左ˉ右軸（left-right axis）。對兩棲動物胚胎的研究發現背ˉ腹軸早在受精后即可觀察到，如爪蛙胚胎皮層轉動形成的灰色新月區在后期發育成背部。德國發育生物學家Hans Spemann和他的學生Hilde Mangold將原腸早期蠑螈胚胎的背部組織移植到另一種蠑螈胚胎的腹部，得到了形成雙體軸的胚胎，次級體軸的脊索來自于供體胚胎，而神經管和體節多數來自于受體，這說明該背部組織能誘導周圍受體胚胎的細胞形成神經管，首次提出了胚胎誘導的概念并稱該背部組織為組織者（organizer）。

ripply家族蛋白在2005年被發現并揭示了其部分功能［1］，研究發現ripply1和ripply2特異表達于體節，其中Ripply1蛋白與轉錄輔抑制因子Groucho結合，能夠終止分節基因的表達，維持體節的前后極性。之后對ripply1的研究都集中在其在體節時期對體節發生的作用，而其在早期胚胎模式發生的作用卻研究甚少。但最近在爪蛙中的研究發現ripply家族蛋白能通過其WRPW區域結合多梳蛋白（Polycomb group proteins）起轉錄去抑制的作用，并且在背ˉ腹軸形成過程中起重要作用［2］。然而，ripply家族基因在胚胎發育早期的表達圖式和調節方式還不清楚。并且，ripply3是人的唐氏綜合征關鍵區域基因6（Down syndrome critical region gene 6，dscr6）的同源基因［3］。因此，研究ripply家族基因的功能和作用機制能為人類遺傳疾病的致病機理提供信息。我們通過原位雜交技術發現ripply1在斑馬魚早期胚胎中特異表達在背部，因此推測其可能參與背腹發生。故而通過過表達ripply1，并調取1.2 kb的啟動子片段，初步研究其在胚胎早期背腹發生的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

AB品系的斑馬魚養殖在28.5℃的循環水系統中，如早期工作所描述［4］。

1.2 方法

1.2.1 獲取ripply1 cDNA

取斑馬魚胚盾（shield）時期的胚胎50枚，用Trizol方法提取胚胎總RNA，使用Transgene公司TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉錄，詳細步驟參見使用說明書。

1.2.2 斑馬魚ripply1整胚原位雜交

調取ripply1全長cDNA，引物序列如下ripply1-F：5’-CAGCGCCAAACAAAACG-3’，ripply1-R：5’-TCAAATTCGCACAGACGG-3’，使用Taq酶擴增后將其連入pGEM-T載體中。根據測序方向合成地高辛標記的反義RNA作為探針使用。其他探針如goosecoid（gsc）、chordin（chd）、floating head（flh）、even-skipped-like 1（eve1）、T-box6（tbx6）、wnt8a詳見作者以前的工作［5］。

合成的ripply1反義RNA用原位雜交液hyb+（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20，0.5 mg/mL酵母RNA，0.05 mg/mL肝素）稀釋至1 ng/μL。收集不同時期的斑馬魚胚胎，固定于4%多聚甲醛中過夜。過渡到含0.1%Tween-20的PBST中，并在PBST中將胚胎膜剝去，用PBST洗過后在原位雜交液hybˉ（50%甲酰胺，5×SSC，0.1%Tween-20）中65℃孵育10 min，之后在hyb+中65℃孵育4 h。探針60℃孵育過夜。第2天吸出探針以重復使用。胚胎用洗液I（50%甲酰胺，2×SSC，0.1%Tween-20）洗30 min（60℃），重復1次；用洗液II（5%甲酰胺，0.2×SSC，0.1%Tween-20）洗15 min（60℃），重復1次；用洗液 III（0.5%甲酰胺，0.02×SSC，0.1%Tween-20）洗30 min（60℃），重復1次。然后用MABT在室溫下洗3次，用封閉液封閉4 h。偶聯堿性磷酸酶的地高辛抗體1∶2500稀釋于封閉液中，4℃孵育過夜。第3天吸出抗體以重復使用，用MABT在室溫下洗30 min，重復1次；用PBST在室溫下洗30 min，重復1次；在平衡緩沖液（0.1 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl pH 9.5，0.05 mol/L MgCl2，0.1%Tween-20）中平衡10 min，加顯色液（5 mL平衡緩沖液中加100μL 60 mg/mL左旋咪唑，100μL NBT/BCIP），室溫避光，待信號足夠強加多聚甲醛終止反應，在70%酒精中脫去浮色，拍照觀察。

1.2.3 顯微注射ripply1 mRNA

顯微注射方法詳見早期工作［5］。ripply1 mRNA注射劑量為每個胚胎200 pg。

1.2.4 ripply1啟動子序列及轉基因魚的獲得

從基因組中調取ripply1基因組上游約1.2 kb的片段，引物如下：promoter-F：5’-ATTCTCGAGGGATCCAAAACAGCTTAT-3’，promoter-R：5’-ATTAGATCTGAATGAATGAAGGCGCGT-3’。并且在上下游引物中分別引入Xho I和Bgl II酶切位點，雙酶后切連入pT2A200R150G載體。

單獨注射該質粒觀察胚胎是否有熒光。有熒光后將該質粒和轉座酶mRNA共注射，劑量均為50 pg，待該批注射的斑馬魚F0代性成熟后外交，篩選后代胚胎有特異熒光的F1代。

2 結果

2.1 整胚原位雜交揭示ripply1在斑馬魚早期胚胎發育過程中的表達模式

為了明確ripply1是否參與早期背ˉ腹軸的形成，我們首先利用整胚原位雜交檢測該基因的時空表達圖式。結果顯示ripply1母源表達，但表達水平低。在原腸作用早期即胚環期表達增強且集中在預定背部的胚盾位置，在胚盾期ripply1在背部的表達繼續增強，并且向側部延伸。在原腸期，隨著細胞運動的進行，ripply1主要表達在前脊索板中胚層和后部將要形成的體節中，但在脊索中胚層中沒有表達（圖1）。這個表達圖式暗示ripply1基因可能在背ˉ腹軸和前ˉ后軸形成過程中起調節作用。

2.2 高表達ripply1導致胚胎背部化

我們下一步對ripply1在背ˉ腹軸形成中的作用進行了功能檢測。在胚胎1細胞期通過注射ripply1 mRNA進行高表達，收集胚盾時期的胚胎進行原位雜交。分別檢測背部標記基因gsc、chd、flh和腹部標記基因eve1、tbx6、wnt8a的表達。我們發現幾乎所有ripply1注射的胚胎背部標記基因gsc、chd、flh表達不但在背部增強并且明顯向腹側擴增。相反，腹部標記基因eve1、tbx6、wnt8a表達明顯減弱（圖2）。這個結果說明高表達Ripply1改變了背腹細胞的命運，使背部區域擴大。顯示ripply1能調節斑馬魚背部的發育。

注：（A-B）1細胞期胚胎側面觀和動物極觀，顯示ripply1的母源表達。（C-G）分別為相應時期的側面觀。動物極向上。（H-J）分別為相應時期的動物極觀，胚胎背部向下，（K-M）分別為相應時期的背部觀，胚胎前部向上。圖1 整胚原位雜交顯示ripply1在斑馬魚早期胚胎發育過程中表達圖式Note.（A-B）1-cell stage lateral view and animal pole view，showing ripply1 maternal expression.（C-G）Lateral view of indicated stageswith animal pole on the top.（H-J）Animal pole view of indicated stageswith dorsal side on the bottom.（K-M）Dorsal view of indicated stageswith anterior region on the top.Fig.1 ripply1 maternal and zygotic expression patterns in early zebrafish developmental stages.

在10 hpf（胚芽期）時觀察胚胎的表型，發現原本呈球形的胚胎前后伸長，呈現明顯的橢球形，這是典型的背部化表型（圖3A，B）。24 hpf后觀察胚胎，大多數胚胎（82/99）表現出背部化，其中36枚胚胎頭部增大，尾部缺失（圖3C，D），而46枚胚胎頭部明顯增大，體軸變短，尾部變短，無腹部尾鰭（圖3E），一小部分胚胎（6/99）甚至呈現雙體軸（結果未顯示）。這些表型進一步說明ripply1通過抑制胚胎后部發育來促進前部的發育。

注：（A，C，E，G，I，K）未注射ripply1 mRNA相應基因在胚盾期表達情況，動物極觀，背部處在右邊。（B，D，F，H，J，L）注射ripply1 mRNA后相應基因在胚盾期表達情況，動物極觀，背部處在右邊。數據顯示該結果所占的比例。圖2 高表達ripply1后背腹標記基因在胚盾期的變化Note.（A，C，E，G，I，K）The expression of indicated genes at shield stage in uninjected embryos.Animal pole view and dorsal is to the right.（B，D，F，H，J，L）The expression of indicated genes at shield stage in ripply1 mRNA-injected embryos.Animal pole view and dorsal is to the right.Fig.2 ripply1 overexpression causes the expression pattern changes of dorsal-ventralmarker genes.

注：（A，C）胚牙期（10 hpf）和24 hpf野生型胚胎。（B）注射ripply1 mRNA胚胎在尾芽期呈橢圓型。（D）嚴重表型。（E）較輕表型。圖3 高表達ripply1后導致胚胎背部化和軀干及尾部缺失。Note.（A，C）Bud stage（10 hpf）and 24 hpfwild-type（WT）embryo.（B）Oval shape of ripply1 dorsalized embryo atbud stage.（D）Severe phenotype and（E）slightlymild phenotype.Fig.3 Dorsalized phenotype and trunk and posterior truncation of ripply1 injected embryos.

2.3 ripply1啟動子及轉基因斑馬魚

為了研究ripply1時空表達的調節機制，我們開展了對其啟動子的研究。獲得ripply1轉錄起始位點上游1.2kb的片段后，將其后加EGFP，然后克隆到pT2A200R150G轉基因載體上（圖4A，B）。質粒注射后發現在胚盾期在胚盾處有特異的熒光表達（圖4C，D），體節期在體節處有特異的表達（結果未顯示），說明該1.2 kb的片段能夠調控ripply1在斑馬魚胚胎中時空特異的表達。與轉座酶共注獲得轉基因魚ripply1：EGFP的F0代，發現其子代在1細胞期即有熒光，直到胚盾期仍是泛表達（圖5AC’），可能是由于EGFP比較穩定，而母源的ripply1比較容易降解。在體節期該熒光則特異定位在軀干（圖5D，D’）。在24 hpf，EGFP信號主要集中在體節中（圖5E），而在成魚中，EGFP信號主要集中在整個軀干部分（圖5F-G’）。

注：（A）ripply1轉錄起始位點上游1.2 kb序列。（B）ripply1：EGFP質粒圖譜。（C，D）注射ripply1：EGFP質粒后熒光信號位于胚盾期胚胎的背部。動物極觀（C）和側面觀（D）。圖4 注射ripply1：EGFP質粒后在胚盾期熒光表達情況Note.（A）1.2 kb ripply1 promoter sequence upstream of the transcription start site.（B）ripply1：EGFP plasmid map.（C，D）Localization of fluorescence signal driven by the1.2 kb ripply1 promoter sequence on the dorsal side of the shield stage embryo.Animal pole view（C）and lateral view（D）.Fig.4 Localization of fluorescence on the dorsal side at shield stage following injection of ripply1：EGFP plasmid

注：（A，B）受精后10 min和1細胞期胚胎熒光信號。側面觀。（C，C’）胚盾期熒光信號。動物極觀和側面觀。（D，D’）體節期胚胎熒光信號。D’是D的軀干部放大圖。（E）24hpf熒光信號。（F，G）斑馬魚成魚及軀干放大部分。（F’，G’）成魚及軀干放大部分的熒光信號圖5 ripply1啟動子轉基因F1代魚的熒光表達圖式Note.（A，B）Fluorescence at10 min after fertilization and 1 cell stage embryos.（C，C’）A shield stage embryo，animal pole view and lateral view，respectively.（D，D’）A somite stage embryo.D’is a highermagnification of the trunk region in D.（E）A 24 hpf embryowith fluorescence restricted in the somites.（F，G）An adult fish.G is a highermagnification of F at the trunk region.（F’，G’）Fluorescence pattern in F and G，respectively.Fig.5 Fluorescence signal in ripply1 promoter-driven GFP F1 progeny transgenic fish

3 討論

近年來許多研究關注ripply1在體節發生中的作用，ripply家族基因包括ripply1、ripply2、ripply3，其與T-box蛋白存在相互作用，三者均可通過結合tbx24抑制其轉錄激活［6］。爪蟾中Ledgerline可明顯抑制Tbx6的表達［7］，Bowline同樣能夠抑制tbx6對下游基因的激活作用［8］。對ripply基因家族的進化樹分析表明ripply1基因只出現在后口動物中，非洲爪蟾中無ripply1，存在兩個ripply2同源基因Ledgerline/ripply2.1和 Bowline/ripply2.2，可能會補償ripply1的作用［9］。另有爪蛙研究表明XDSCR6/ Ripply3通過拮抗多梳家族蛋白（polycomb group proteins）參與胚胎背腹軸的形成［2］，該研究為我們研究斑馬魚中Ripply1參與胚胎背腹軸形成提供了一種可能的機制。

原位雜交結果表明ripply1特異定位在胚盾期的背部，可能參與背腹發生，高表達ripply1能增強背部基因的轉錄水平并抑制腹部基因的轉錄，導致胚胎背部化表型，因此，我們的實驗結果說明ripply1在胚胎背腹軸形成方面有重要作用。這些結論與在爪蛙中研究XDSCR6/Ripply3所得到的結果一致［2］。

原位雜交揭示的是mRNA的表達模式，而啟動子的研究則可以在一定程度上揭示基因在蛋白水平的表達模式，單獨注射ripply1：EGFP質粒只能在胚盾期觀察到特異熒光，而轉基因魚結果則證明其母源表達，說明卵母細胞中有蛋白可以調控ripply1的表達，而受精之后合子基因的表達決定了ripply1在胚盾期的特異定位。

因此我們推測ripply1可能參與胚胎背腹軸，并且是發生在合子基因開始表達之后，但母源表達可能會對該作用有一定的影響。我們仍然需要ripply1敲除后的結果，以證明其在背腹發生過程中是必要的，而且ripply1以何種方式參與，是否涉及Wnt、BMP信號通路或者也是通過表觀遺傳水平調節背腹基因的表達仍待進一步的研究。啟動子序列的獲得有助于我們獲得ripply1上游調控蛋白，從而繪制出完整的基因調控圖譜。

［1］ Kawamura A，Koshida S，Hijikata H，etal.Groucho-associated transcriptional repressor ripply1 is required for proper transition from the presomitic mesoderm to somites［J］.Dev Cell，2005，9（6）：735ˉ744.

［2］ Li HY，Grifone R，Saquet A，et al.The Xenopus homologue of Down syndrome critical region protein 6 drives dorsoanterior gene expression and embryonic axis formation by antagonising polycomb proteins［J］.Development，2013，140（24）：4903ˉ 4913.

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［4］ Cao JM，Li SQ，Shao M，et al.The PDZ-containing unconventionalmyosin XVIIIA regulates embryonicmuscle integrity in zebrafish［J］.JGenet Genomics，2014，41（8）：417ˉ428.

［5］ Cao JM，Li SQ，Zhang HW，et al.High mobility group B proteins regulate mesoderm formation and dorsoventral patterning during zebrafish and Xenopus early development［J］.Mech Dev，2012，129（9ˉ12）：263ˉ274.

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［8］ Kondow A，Hitachi K，Okabayashi K，et al.Bowlinemediates association of the transcriptional corepressor XGrg-4 with Tbx6 during somitogenesis in Xenopus［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，359（4）：959ˉ964.

［9］ Janesick A，Shiotsugu J，TaketaniM，etal.RIPPLY3 is a retinoic acid-inducible repressor required for setting the borders of the pre-placodal ectoderm［J］.Development，2012，139（6）：1213ˉ1224.

科技工作者科學道德規范（一）

【編者按】學術不端行為是指違反學術規范、學術道德的行為，國際上一般用來指捏造數據（fabrication）、竄改數據（falsification）和剽竊（plagiarism）三種行為。但是一稿多投、侵占學術成果、偽造學術履歷等行為也可包括進去。學術不端行為在世界各國、各個歷史時期都曾經發生過，但是像中國當前這樣如此泛濫，嚴重到被稱為學術腐敗的地步，卻是罕見的。這不僅表現在違反者眾多、發生頻繁，各個科研機構都時有發現，而且表現在涉及了從院士、教授、副教授、講師到研究生、本科生的各個層面。由于目前中國缺乏學術規范、學術道德方面的教育，科技工作者在學習、研究過程中發生不端行為，經常是由于對學術規范、學術道德缺乏了解，認識不足造成的。因此，對科技工作者進行學術規范、學術道德教育，防患于未然，是遏制學術腐敗、保證中國學術研究能夠健康發展的一個重要措施。

早在2007年，中國科協就發布了科技工作者科學道德規范，本刊重溫此規范，以期在我刊營造一種健康的學術研究氛圍，由于版面限制，我刊陸續將規范全文刊出。

第一章總則

第一條為弘揚科學精神，加強科學道德和學風建設，提高科技工作者創新能力，促進科學技術的繁榮發展，中國科學技術協會根據國家有關法律法規制定《科技工作者科學道德規范》。

第二條本規范適用于中國科學技術協會所屬全國學會、協會、研究會會員及其他科技工作者。

第三條科技工作者應堅持科學真理、尊重科學規律、崇尚嚴謹求實的學風，勇于探索創新，恪守職業道德，維護科學誠信。

第四條科技工作者應以發展科學技術事業，繁榮學術思想，推動經濟社會進步，促進優秀科技人才成長，普及科學技術知識為使命。以國家富強，民族振興，服務人民，構建和諧社會為己任。

（待續）

The role of ripply1 in zebrafish dorsal-ventral development

MENG Ya-ping1，2，LIU Chun-ye1，SHIDe-li1*
（1.School of Life Science，Shandong University，Jinan 250100，China 2.School of Life Science，Tsinghua University，Beijing 100084）

ObjectiveTo explore the role of ripply1 in zebrafish dorsal-ventral development.M ethodsUsing zebrafish whole-mount in situ hybridization to examine the ripply1 expression pattern in early embryo development.To analyse the expression pattern changes of dorsal-ventral marker genes at shield stage and the morphological changes at 24 hpf（hours post-fertilization）after overexpression of ripply1 by injecting syntheticmRNA at1-cell stage.Using Tol2 transposon technology to obtain a ripply1 promoter driven GFP transgenic fish and to identify promoter region that recapitulates endogenous ripply1 expression pattern.ResultsThe in situ hybridization results revealed that ripply1 specifically expresses in the future dorsal region at shield stage.Overexpression of ripply1 caused an enhanced expression of dorsalmarker genes and a reduction of ventralmarker genes.Embryos overexpressing ripply1 also showed severely dorsalized phenotype，with enlarged head，reduced ventral yolk extension，and shortened posterior trunk and tail regions，and the formation of a secondary trunk axis.Transgenic fish revealed thematernal expression of ripply1 and suggested thata1.2 kb promoter-driven GFP is able to recapitulate the endogenous gene expression pattern.Conclusionripply1 may participate in the early developmentof dorsal-ventral axis in zebrafish embryo.

Zebrafish；ripply1；Early embryo development；Dorsal-ventral axis

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0446-07

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.002

2015-07-29

國家自然基金項目資助（No：31271556，31471360，J1103515）。

孟亞平，女，博士研究生，研究方向：Wnt信號通路，胚胎誘導核體軸形成。

石德利，男，博士，研究方向：Wnt信號通路，胚胎誘導核體軸形成。Email：dshi@sdu.edu.cn