一種在紫外敏感型視錐細胞中特異表達tdTomato的轉基因斑馬魚系的構建

陳哲，宋著，王雅冬，趙呈天

（中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003）

研究報告

一種在紫外敏感型視錐細胞中特異表達tdTomato的轉基因斑馬魚系的構建

陳哲，宋著，王雅冬，趙呈天*

（中國海洋大學海洋生物多樣性與進化研究所，山東 青島 266003）

目的鑒于目前對斑馬魚視錐細胞視蛋白運輸機制并不明確，且缺乏相應的抗體，本實驗擬構建一種可以在視錐細胞中特異表達熒光的轉基因斑馬魚。方法利用編碼紫外敏感型視蛋白基因（sws1）的啟動子，構建了一種在紫外敏感型視錐細胞中特異表達紅色熒光蛋白tdTomato的轉基因斑馬魚。同時，將tdTomato熒光蛋白與非洲爪蟾rhodopsin蛋白末端44個氨基酸相融合，將該融合蛋白定位于紫外敏感型視錐細胞的外節段，進而可模擬內源性視蛋白的定位。結果共篩選出三種不同品系的轉基因斑馬魚，經過免疫組化分析，確定其中一種轉基因品系是正確的目標品系。結論該轉基因斑馬魚的構建將會為進一步研究視錐細胞中視蛋白的運輸機制提供幫助。

斑馬魚；視錐細胞；紫外敏感型；SWS1；UV opsin；轉基因

感光細胞是接收光信號并將其傳遞至大腦形成視覺的第一場所，是視網膜中最重要的神經元細胞之一。感光細胞由外節段（outer segment）、內節段（inner segment）、細胞核區及突觸區等部分組成，其中外節段與內節段由連接纖毛（connecting cilium）相連，是外節段蛋白運輸的主要通道（圖1A）。根據外節段的形狀差異，感光細胞可分為視桿細胞（圓柱形）和視錐細胞（圓錐形）兩種，其中視桿細胞可感受弱光形成暗視覺，視錐細胞可感受強光形成明視覺，并具有顏色識別性［1］。感光細胞接收光信號主要是通過一種G蛋白偶聯的跨膜受體蛋白——視蛋白（opsin）來完成。視蛋白產生于感光細胞內節段，通過連接纖毛運輸到外節段，富集于外節段內的膜盤（membrane disk）上行使功能。依據對光線敏感程度的差異，視錐細胞視蛋白可分為長波敏感型（long-wavelength sensitive，LWS）（紅光敏感）、中波敏感型（middle-wavelength sensitive，MWS）（綠光敏感）和短波敏感型（short-wavelength sensitive，SWS）（藍光敏感）三種。相應的，視錐細胞也分為L型、M型以及S型等三種不同類型。在部分脊椎動物（如斑馬魚）中，除了上述幾種感光色素之外，還存在一種對紫外敏感的短波敏感型視蛋白，即SWS1（short-wavelength sensitive type 1）視蛋白或UV視蛋白［2，3］。

斑馬魚具有與人類似的視網膜組成，其感光細胞的結構及功能與人類似，且發育時間較短，是理想的研究感光細胞的發育及視覺形成機制的模式動物。斑馬魚有五種感光細胞，包括一種視桿細胞和四種視錐細胞［4］。其中紅光敏感型和綠光敏感型視錐細胞可相互結合，形成雙錐細胞，紫外敏感型和藍光敏感型視錐細胞均為單錐細胞，且紫外敏感型視錐細胞長度要短于藍光敏感型視錐細胞。斑馬魚感光細胞首次出現在胚胎發育至43～48 hpf（hour post fertilization）之間，在胚胎發育至72 hpf后，形成較為成熟的感光細胞層。對不同視蛋白基因的原位雜交結果表明，紅光敏感的視錐細胞首先出現，然后是綠光敏感型和藍光敏感型，紫外敏感型的視錐細胞最晚形成［5，6］。在成熟的斑馬魚視網膜中，感光細胞具有非常精細的馬賽克排列方式，這種排列與細胞極性蛋白Crumbs的存在密切相關［7］。

感光細胞凋亡與多種人類疾病密切相關，包括視網膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP），Leberˊs先天性黑朦癥（Leberˊs congenital amaurosis，LCA）等，是導致人類失明的重要原因，研究表明視蛋白的功能及運輸缺陷是導致感光細胞凋亡的重要誘因［8，9］。由于外節段缺乏相應的蛋白合成系統，所有蛋白均是在內節段合成，經連接纖毛運輸至外節段（圖1A），該運輸環節出現問題可導致感光細胞的凋亡，因此研究視蛋白的運輸機制顯得尤為重要。

對斑馬魚視蛋白運輸機理研究的一個重要手段是通過抗體免疫染色，分析測視蛋白的定位，而目前僅視桿細胞的視蛋白有較好的抗體，對視錐細胞視蛋白的抗體使用較少。同時，由于不同視錐細胞視蛋白在結構上存在非常大的相似性，其抗體使用也存在著交叉結合的風險。為了更好的研究斑馬魚視蛋白運輸的分子機制，我們利用sws1視蛋白基因的啟動子構建了一種在紫外敏感型感光細胞中特異表達熒光蛋白tdTomato的轉基因斑馬魚。我們將td-Tomato基因與編碼非洲爪蟾rhodopsin末端44個氨基酸的基因片段相連接，后者可幫助tdTomato定位至視錐細胞的外節段，并模擬視蛋白的運輸及定位［10，11］。我們已成功獲得了相應的轉基因斑馬魚，并驗證了其表達的特異性，該轉基因斑馬魚將為進一步研究視錐細胞視蛋白的運輸機制提供便利。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用野生型斑馬魚為Tübingen品系，由中國海洋大學藥學院分子醫學生物學研究室獲得。同時，為減少熒光觀測時黑色素的干擾，我們將所獲得的轉基因品系與斑馬魚白化突變體albino進行了交配。

1.2 載體構建

首先，將5.5 kb sws1基因啟動子（從Dr Kawamura處獲得）克隆至Gateway載體p5E-MCS上；后通過PCR擴增含有HA標簽序列的tdTomato基因，并通過BP反應將該片段連接到pDONR221載體中（所用擴增引物為：HA-TOM-P5：ATGTACCCATACGATGTTCC-AGATTACGCTGTGAGCAAGGG CGAGGAG，HA-TOM-P3：GGGGACCACTTTGTACA AG-AAAGCTGGGTACTTGTACAGCTCGTCCATGC），編碼爪蟾opsin羧基端44氨基酸的片段克隆至p2rp3載體［11］，最后將上述三個載體與目標載體pDEST-Tol2pA2通過Multisite Gateway的方式進行連接，具體載體信息見參考文獻［12］。

1.3 顯微注射及轉基因品系篩選

將表達載體與編碼轉座酶（transposase）的mRNA共同注射至單細胞時期的斑馬魚胚胎中，注射終濃度分別為30 ng/μL和100 ng/μL。5 d后，在熒光顯微鏡下挑選眼睛有紅色熒光的胚胎進行養殖，至成魚后進行隨機交配，篩選F1代眼睛有紅色熒光的F0品系。

1.4 冰凍切片及免疫組化

首先將胚胎或成魚眼睛用4%多聚甲醛4℃固定過夜，1×PBST洗兩次，每次5 min，然后加入含30%蔗糖的PBST脫水；4℃過夜后，將胚胎放入冰凍包埋劑中，調整到合適位置，置于ˉ20℃，包埋劑凝固后進行冰凍切片機切片，厚度約12μm。收集的切片置于室溫干燥4 h或者4℃過夜，然后PBST水化，用封閉液（10%山羊血清，90%PBST，0.5% Triton X-100）封閉45 min；加入一抗，4℃過夜；之后1×PBST洗3次，加入二抗，室溫反應4 h，1×PBST洗2次，然后進行共聚焦顯微鏡（Leica Sp8）觀測。本實驗所用抗體比例為：zpr-1小鼠單克隆抗體（ZIRC，1∶250），zpr-3小鼠單克隆抗體（ZIRC，1∶250）以及HA單克隆抗體（Santa Cruz，1∶250）

2 結果

2.1 載體構建

為更好地研究脊椎動物視錐細胞視蛋白的運輸機理，我們設計了一種編碼紅色熒光蛋白的嵌合基因tdTomato-CT44，其中紅色熒光蛋白編碼基因td-Tomato與編碼非洲爪蟾Opsin末端44個氨基酸的序列相互融合。在表達的嵌合蛋白中，末端的44個氨基酸可將融合蛋白定位于感光細胞外節段。進一步利用Multisite Gateway技術，將該嵌合基因連接到sws1基因的5.5 kb啟動子后，從而保證該融合蛋白在紫外敏感型的視錐細胞中特異表達［13］。同時，為了提高轉基因篩選的效率，將整個表達片段克隆到了具有Tol2轉座子的目標載體上（圖1B）。

注：A：視桿細胞的結構示意圖；B：Tol2轉基因表達載體示意圖；C，D：注射表達載體5 d后幼魚眼睛熒光照片，注射幼魚（D）在眼睛晶體中有明顯紅色熒光，而未注射幼魚（C）眼睛僅有自發熒光現象。A中縮寫詞：OS（outer segment）：外節段；CC（connecting cilium）：連接纖毛；CB（cell body）：細胞體；NU（nucleus）：細胞核；SY（synapse）：突觸。圖1 表達載體構建及顯微注射Note.A：Diagram of a rod photoreceptor cell；B：Diagram of the Tol2 construct formaking transgenic line；C，D：Images of5dpf zebrafish larvae showing red fluorescence in the lens of injected embryo（D），while only auto-fluorescence exists in the control larvae（C）.Fig.1 Diagram ofmicroinjection and Tol2 construct

2.2 顯微注射及轉基因篩選

將該表達載體和編碼轉座酶的mRNA共同注射到單細胞時期的斑馬魚胚胎中，在胚胎發育至5 d時，在眼睛晶體處有明顯的熒光表達（圖1D）。后我們進行了大量注射培養，共獲得約50條F0成魚。之后，對F0進行隨機交配，篩選F1代具有熒光特異表達的品系。在篩選的過程中，由于眼睛存在自發熒光現象（圖1C，D），我們通過冰凍切片進行了進一步的驗證。

2.3 穩定表達轉基因品系的建立

我們共獲得三種F0轉基因品系，免疫染色結果表明三種品系熒光蛋白的表達有明顯差異：F0-1轉基因胚胎中紅色熒光的表達主要成點狀，存在于視錐細胞的突觸部位（圖2A）。進一步DAPI染色顯示該表達部位并非細胞核（圖未出示）；F0-2轉基因胚胎中紅色熒光主要存在于感光細胞細胞體（cell body）中，同時也存在類似于F0-1的點狀分布（圖2B）；F0-3轉基因胚胎中紅色熒光的表達完全存在于外節段，而且可看到明顯的圓錐狀，說明其為目標品系（圖2C）。

我們對F0-3的轉基因品系進行了傳代，對F2代胚胎的免疫組化分析表明其具有與F1代完全相同的亞細胞定位，表明轉基因品系構建成功。同時，分別收集3、5 d和7 d的F2代胚胎，進行冰凍切片及免疫染色，結果表明紅色熒光蛋白在發育至3 d左右開始表達，并主要定位于視錐細胞的外節段。隨著胚胎的發育，可觀察到外節段逐漸延伸，呈明顯圓錐狀（圖3A-C）。同時，HA抗體染色的結果表明其染色部位與tdTomato熒光蛋白表達部位完全重疊，排除了胚胎自發熒光的干擾（圖3D）。最后，我們利用視桿細胞視蛋白抗體zpr3進行了免疫染色（圖3E），結果表明tdTomato的存在部位與zpr3的染色部位并不重合，且均位于zpr3染色基底部位下方。

注：A，B，C：紅色熒光蛋白的表達位置；A1，B1，C1：zpr1免疫熒光染色，顯示雙錐細胞的位置；A2，B2，C2：鬼筆環肽（phalloidin）染色，顯示肌動蛋白的位置；A3，B3，C3：為三種的疊加。圖2 三種不同轉基因斑馬魚視網膜切片免疫染色圖Note.Confocal images of the retinal cells stained with zpr-1 antibodies（A1，B1，C1）.Sectionswere also counterstained with phalloidin to label the actin filaments（A2，B2，C2）.Fig.2 Immunohistochemistry of the retinal cells in three transgenic zebrafish lines.

3 討論

研究視蛋白的運輸機理對認識感光細胞的凋亡及相應的視網膜疾病具有重要意義。斑馬魚感光細胞的結構與人類似，研究其視蛋白運輸機制可對視網膜色素變性等疾病的研究提供有力支持。目前對視蛋白研究的一個瓶頸問題在于缺乏有效的檢測抗體，雖然針對斑馬魚不同視蛋白的抗體已經有報道［3］，但是由于存在特異性的擔心，在視蛋白的研究中還沒有廣泛采用。目前，僅有針對視桿細胞視蛋白的抗體（zpr3）得到廣泛認可。

為更好的研究視錐細胞視蛋白的運輸機制，本實驗建立了一種在紫外敏感型視錐細胞中特異表達紅色熒光蛋白tdTomato的轉基因魚品系。同時，通過將tdTomato與視蛋白末端44個氨基酸相融合，使得該熒光蛋白特異定位于視錐細胞外節段，并模擬內源性視蛋白的定位，從而為視蛋白運輸機制的研究提供了新型的研究工具。在視桿細胞外節段，每天更新約10%的視蛋白，因此需要大量的視蛋白合成及運輸。為適應這一需求，感光細胞產生了一種特有的高效運輸機制：除非有特異的非外節段定位信號，感光細胞外節段是幾乎所有膜蛋白的默認運輸目的地［14］。視蛋白末端44個氨基酸具有部分跨膜序列，可將其融合蛋白定位至外節段。但是，實驗中發現這并不是絕對的定位方式，我們除發現在外節段的定位之外，也發現兩種不同的定位（F0-1，F0-2）。在這兩種轉基因品系中，紅色熒光蛋白存在于突觸或者胞體中，與預期結果并不一致。尤其是定位在近突觸部位的轉基因品系中，我們發現其表達的融合蛋白雖成點狀分布，但與核染料DAPI不能共定位。我們推測造成這種定位的原因可能是與轉基因片段在基因組插入位點的特殊性有關，可能插入的位點附近有增強子的存在，導致該蛋白的表達明顯升高，而合成的蛋白未能及時包裝至運輸囊泡中，自我聚集形成類似于內涵體（inclusion bodies）的結構，從而采取不同的運輸機制。

注：A，B，C：不同時期轉基因胚胎zpr-1抗體染色結果（綠色）；D，D1，D2：7 d轉基因胚胎HA抗體染色結果（綠色）；E，E1，E2：7 d轉基因胚胎zpr3抗體染色結果（綠色），藍色為鬼筆環肽的染色。所有圖中，紅色均表示tdTomato的表達。圖3 穩定表達轉基因品系感光細胞切片染色分析Note.Confocal images of the photoreceptors in the stable transgenic zebrafish line stained with zpr-1 antibody（A，B，C），anti-HA antibody（D，D1，D2）and zpr-3 antibody（E，E1，E2）.In all panels，red channel indicates expression of tdTomato in the transgenic zebrafish larvae.Fig.3 Immunoanalysis of photoreceptors in the stable transgenic zebrafish line.

從F0-3的免疫染色結果可以看到，紅色熒光間隔性存在于雙錐細胞胞體之間（zpr1染色），且位置明顯要低于視桿細胞視蛋白（zpr3染色）的定位，這與紫外敏感型視錐細胞長度要短于雙錐細胞和視桿細胞有關。同時，對成魚視網膜的橫切染色，可以看到精確的馬賽克排列圖案（未出示），與預期的感光細胞排列方式完全一致，表明在該品系中，紅色熒光蛋白tdTomato完全特異存在于紫外敏感型視錐細胞中。該轉基因魚的建立對下一步研究視錐細胞視蛋白的運輸及亞細胞定位分布具有重要的幫助。

（致謝 感謝日本東京大學的Kawamura教授提供UV opsin啟動子，同時感謝中國海洋大學藥學院分子醫學生物學研究室提供斑馬魚品系。）

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Fstablishment of a transgenic zebrafish line w ith tdTomato expression in the ultraviolet-sensitive cone photoreceptors

CHEN Zhe，SONG Zhu，WANG Ya-dong，ZHAO Cheng-tian
（Institute of Evolution&Marine Biodiversity，Ocean University of China，Qingdao，Shandong 266003，China）

ObjectiveTo better understand themechanisms of cone opsin transport，we set to generate a transgenic zebrafish linewith red fluorescence proteins expressing in the cone photoreceptors.M ethodsWe used sws1 promoter to drive the expression ofa chimerical protein，in which the last44 amino acids of rhodopsin of Xenopus laevis were fused to the C-terminus of tdTomato to restrict its localization to the outer segment of photoreceptors.ResultsWe successfully isolated such a transgenic zebrafish line and confirmed the localization of tdTomato by immunostaining analysis.ConclusionsThis transgenic zebrafish line will help us to better understand the transportmechanisms of cone opsins，especially the transport in live photoreceptors.

Zebrafish；Cone photoreceptor；Ultraviolet-sensitive；sws1；UV opsin；Transgene

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0453-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.003

2015-08-07

國家自然科學基金項目（31372274，81301718）。

陳哲（1995ˉ），男，生物化學與分子生物學專業，本科，研究方向：斑馬魚眼睛發育。E-mail：craz2012@126.com

趙呈天，教授，研究方向：胚胎發育。E-mail：chengtian_zhao@ouc.edu.cn