輻照劑量率對明膠自由基和性能的影響

耿勝榮，陳玉霞，鉏曉艷，李 新，江洪有

（湖北省農業科學院 農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

輻照劑量率對明膠自由基和性能的影響

耿勝榮，陳玉霞，鉏曉艷，李 新，江洪有

（湖北省農業科學院 農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064）

為探討劑量率對明膠分子輻照分解的影響機理，采用電子自旋共振（ESR）、凝膠滲透色譜（GPC）等檢測技術分析明膠經劑量率為60、480Gy／min60Co以及劑量率為12 000Gy／min加速器輻照0～32kGy劑量后，自由基特征、明膠性能與劑量率的關系。結果表明，未輻照明膠ESR信號微弱，三種輻照方式處理后的明膠均呈現相似的ESR雙峰特征；相同吸收劑量下，明膠自由基信號強度由大到小依次為60Gy／min60Co輻照明膠、480Gy／min60Co輻照明膠和12 000Gy／min加速器輻照明膠；60Co輻照后自由基信號強度（y）與劑量（x）的線性關系為y＝26.983x2＋1 641.8x－205.69；輻照明膠特性黏度、平均相對分子質量、凝膠強度和斷裂伸長率由高到低依次為480Gy／min60Co輻照明膠、12 000Gy／min加速器輻照明膠和60Gy／min60Co輻照明膠。可見，高劑量率輻照可能減少明膠中有效長壽命自由基的含量，從而抑制明膠輻照滅菌中性能的劣變。

明膠；輻照；加速器；劑量率

低劑量率輻照會產生兩種效應：低劑量刺激效應和輻射損傷效應。極低劑量率為正效應，可誘導農作物性狀改良［1］和品種改良、臨床上殺滅癌細胞的同時保護機體細胞。輻射損傷為負效應，可導致DNA雙鏈和單鏈斷裂［2］，紅細胞及膜損傷［3］，胸腺細胞凋亡［4］和癌細胞自我修復增強以及航空、軍事和工業元器件［5－6］的應用性能下降。明膠輻照滅菌已沿用傳統工藝多年，應用發現，輻照后明膠出現黏度下降的現象。當明膠的初始帶菌量高、初始黏度低時，輻照后的明膠細菌含量符合要求，但黏度大幅下降，由此降低或失去應用價值（GB 6783—94要求：明膠勃氏黏度大于1.8mPa·s，凝凍強度大于100g）［7］。但這種現象在同等劑量加速器輻照或裝源量大的鈷源輻照時可避免。因此，研究低劑量率損傷效應具有重要意義。

水、蛋白質和氧氣輻照分解產生OH·、H·、ea－q、HO2·、O2－、RCH·CO2－、NH3＋C·（R）CO2－等自由基［8］，這些自由基間、自由基與分子間、分子內、分子間會發生多級反應，引起明膠分子的交聯、斷裂及其他變化［9］。由于自由基含有未成對電子，具有自旋角動量，能產生磁性和自旋磁矩［10］，常用電子自旋共振（ESR）譜儀檢測其信號強度和自由基濃度［11－13］。ESR技術主要應用于木荷、絲綢［14］、聚丙烯腈纖維［15］、化學反應研究［16］等領域，用于研究劑量率輻射損傷效應的報道較少。

本文采用ESR等技術，檢測明膠經不同劑量率鈷源和加速器輻照后，自由基含量及結構的特性變化，探討劑量率對明膠輻射損傷的效應，為建立高劑量鈷源（或加速器）輻照明膠滅菌工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

明膠：CP級，國藥集團化學有限公司。

鈷源1：放射性活度1.22×1016Bq（33萬Ci），湖北省輻照實驗中心；鈷源2：放射性活度9.36×1016Bq（253萬Ci），深圳市金鵬源輻照技術有限公司；加速器：10MeV、15kW，深圳戈瑞輻照科技有限公司；JES-FA200電子順磁共振波譜儀：日本電子株式會社；凝膠滲透色譜：1515型高效液相色譜泵、2690D型分離模塊、2410型折射率檢測器、Waters ultrahy drogel 2000型和Waters ultrahy drogel 250型色譜柱，美國Waters公司；Quanta 200型掃描電鏡：荷蘭FEI公司；TA-XTPlus型質構儀：英國SMS公司；50mL稀釋型烏氏黏度計；電子萬能材料試驗機：深圳市瑞格爾儀器有限公司。

1.2 輻照處理及劑量監測結果

將明膠在50℃下鼓風干燥至恒重后，進行定量有氧包裝。包裝后的明膠分別用鈷源1（劑量率約為60Gy／min）、鈷源2（劑量率約為480Gy／min）和加速器（劑量率約為1 200Gy／min）輻照，以硫酸亞鐵劑量計跟蹤吸收劑量。加速器工作條件：功率14.97kW、掃描電流7A、速度2.4～3.0m／min、載高3cm、加速電壓122kV。

鈷源1輻照樣品的吸收劑量分別為4.5、8.7、13.0、17.3、27.3、36.6kGy，鈷源2輻照樣品的吸收劑量分別為8.8、20.2kGy，加速器輻照樣品的吸收劑量分別為8.0、30.6kGy。

1.3 ESR工作條件

初始場的磁感應強度為313.894mT，中心磁場的磁感應強度為323.894mT，磁場掃描寬度為20mT，掃描時間為60s，微波頻率為9 052.252MHz，微波功率為0.998 000mW，測量溫度為室溫。

1.4 指標測定［17］

相對分子質量大小及分布寬度：以0.1mol／mL Na2HPO4（pH＝8.0）為儲備液，0.025mol／mL Na2HPO4（pH＝8.0）為淋洗液，H2O-0.2mol／mL NaNO3為溶劑，進樣量為100μL，淋洗液流速為0.6mL／min。標樣為聚乙烯乙二醇，柱子溫度為40℃，檢測器溫度為40℃。

特性黏度：記錄在37℃恒溫下，一定體積、不同濃度（初始濃度c0及將初始濃度按體積比稀釋為2／3、1／2、1／3和1／4濃度）下明膠水溶液流經烏氏黏度計毛細管的時間。根據溶液流出時間t和蒸餾水流出時間t0，依次計算相對黏度ηr（ηr＝t／t0）和增比黏度ηsp（ηsp＝ηr－1）。以濃度c為橫坐標、ηsp／c和lnηr／c為縱坐標作圖，兩條曲線與縱軸的截距記為H1和H2，其平均值為H，H／c0即為特性黏度［η］。

凝膠強度：按美國試驗標準GMIA采用質構儀測定。

斷裂伸長率：采用膜的拉伸模式試驗標準GB 1040—92進行斷裂伸長率的測定。測試條件：定伸長率20%、標距25mm、試驗速度100mm／min、定應力0.1mPa、試驗面積1.56mm2，測試時輸入膜厚度參數（以mm為單位），斷裂伸長率由計算機直接給出。

表面形貌分析：10%的明膠水溶液在低溫下形成凝膠后，在－80℃冰箱內速凍，再凍干，取少量凍干樣品，真空噴金后，采用掃描電鏡對樣品的表面和截面掃描。

2 結果與討論

2.1 輻照明膠的ESR譜特征

吸收劑量約8kGy的明膠經鈷源1、鈷源2和12 000Gy／min加速器輻照后，用ESR譜儀研究不同劑量率γ射線和電子束照射后明膠自由基信號的變化，結果示于圖1。圖1a顯示，未輻照明膠的自由基信號很弱，且噪聲較大。圖1b顯示，鈷源1和鈷源2輻照明膠后，自由基信號強度相近，加速器輻照后自由基信號強度最低，三者均表現出典型的特征雙吸收峰，幾乎重疊。

圖1 明膠輻照前（a）、后（b）的ESR譜Fig.1 ESR spectra of gelatin before（a）and after（b）irradiation

圖2 20～36kGy吸收劑量明膠的ESR譜Fig.2 ESR spectra of gelatin with 20-36kGy absorbed dosage

鈷源1、鈷源2和加速器輻照后吸收劑量分別為36.6、20.2和30.6kGy的樣品的ESR譜如圖2所示。與8kGy低劑量輻照明膠的ESR譜（圖1）相比，隨著劑量的增加，三種劑量輻照明膠的峰形無明顯變化。吸收劑量較接近的鈷源1（36.6kGy）和加速器（30.6kGy）輻照明膠的峰形高且窄，吸收劑量僅為20.2kGy的鈷源2輻照明膠的峰形矮且寬。

根據分裂因子計算公式g＝0.071 45γ／H（H為共振場的磁感應強度，γ為微波頻率，取9 052.252MHz）和圖2計算g值和ΔH（峰與峰對應磁場的間距），結果列于表1。由表1可見，鈷源1的特征峰參數與加速器的較接近，鈷源2的g值略偏大，ΔH偏小，但差值不大。可見，輻照劑量率并未改變樣品的自由基性質，ESR譜峰形相似，未輻照明膠幾乎無響應信號。低劑量階段（圖1），高劑量率的低自由基信號強度效應較明顯，自由基信號強度由小到大依次為加速器、鈷源2、鈷源1。

電磁波或電子束在明膠蛋白質晶格內會產生輻射缺損，誘導長壽命自由基產生，當與周圍外加磁場相互作用時，會發生自旋共振吸收。鈷源和加速器產生的電子自旋和外加磁場間的相互作用不同，因此形成的譜線線形也略有差異［8，15］。本研究發現，二者產生的自由基的特征峰相似，但強度有差異。

表1 不同輻照方式下明膠ESR特征峰參數的變化Table 1 Changes of parameters of ESR characteristic peak by different ways

2.2 劑量對自由基信號強度的影響

用鈷源1對明膠進行不同劑量輻照，研究吸收劑量與自由基信號強度的關系，結果如圖3所示。在0～36.6kGy吸收劑量范圍內，自由基信號強度（y）與劑量（x）呈現良好的相關性，擬合方程為：y＝26.983x2＋1 641.8x－205.69，R2＝0.994 0。

圖3 輻照明膠的吸收劑量與自由基信號強度的關系Fig.3 Relationship between absorbed dosage and free radical signal of irradiated gelatin

當物質受到電離激發時，處于上下兩能級的電子發生受激躍遷，一部分低能級電子吸收電磁波能量躍遷到高能級，輻射誘發的順磁性物質產額與吸收劑量直接相關［18］，因此，ESR反映的是一定條件下樣品吸收的總能量［19］，能量吸收越多，共價鍵斷裂越多，從而自由基含量越高［20］。本研究中吸收劑量與信號強度呈正相關，與文獻［21］報道的結果一致。

2.3 劑量率對輻照明膠自由基信號強度的影響

用不同劑量率及輻照方式輻照明膠，其自由基信號強度示于圖4。由圖4可見，吸收劑量約為8kGy時，鈷源1、鈷源2和加速器輻照三種方式中，加速器輻照的明膠自由基信號強度最低，鈷源1和鈷源2輻照的明膠自由基信號強度相近；吸收劑量約為20kGy時，鈷源2輻照的明膠自由基信號強度低于鈷源1的；吸收劑量約為30kGy時，加速器輻照的明膠自由基信號強度低于鈷源1的。可見，相同劑量輻照時，自由基信號強度由高到低依次為：鈷源1、鈷源2、加速器。

圖4 輻照劑量率對自由基信號強度的影響Fig.4 Effect of irradiated dosage rate on free radical signal from gelatin

加速器輻照產生的自由基信號強度低于γ射線的，可能是由于加速器電子束穿透能力有限，且作用時間短，單位時間自由基產生量大，使自由基瞬時濃度太高，難以及時擴散，自由基間發生反應而淬滅，造成自由基總量減少。在鈷源輻照中，大劑量率與小劑量率自由基信號強度產生差異與此推理相似，具體機理有待進一步分析研究。

2.4 劑量率對輻照明膠平均相對分子質量的影響

吸收劑量約為8kGy時，不同劑量率輻照后，明膠流經凝膠滲透色譜（GPC）的信號響應值隨時間的變化示于圖5。由圖5可見，鈷源1輻照后明膠的保留時間最長，響應信號峰最矮；加速器輻照與鈷源2輻照后明膠的保留時間相近，但鈷源2峰較高。由GPC測定原理可知，相對分子質量越大，保留時間越短，峰越高。可見，相同吸收劑量下，鈷源2輻照明膠樣品平均相對分子質量最大，其次為加速器輻照的，鈷源1輻照的最小。

根據明膠GPC響應值與標準曲線對比，分析得到相對分子質量。鈷源1、鈷源2和加速器輻照明膠的相對數均分子質量（Mn）分別為2 810、3 875和3 358；相對重均分子質量（Mw）分別為4 389、7 119和5 973；多分散指數（Mw／Mn，用于衡量聚合物分子質量分布的寬度，該值越大，說明分子質量分布越寬，分子質量越不集中）分別為1.56、1.84和1.78。在35～40min之間出現小峰的原因是明膠大分子流出后，小分子保留在樹脂孔里，最后才被洗脫出來，倒峰為溶劑峰。由此可見，相同吸收劑量下，輻照明膠的Mn、Mw由大到小依次為：鈷源2、加速器和鈷源1。但分散指數以鈷源1最低，其次為加速器，鈷源2最高。

圖5 不同劑量率輻照后明膠的凝膠滲透色譜Fig.5 Gel permeation chromatogram of gelatin by different dosage rates

高分子受輻照后最重要的反應為輻照交聯與降解，同時性能發生顯著變化，包括分子質量增加或下降。在相對無水條件下，明膠屬于輻照降解型高分子，在輻照過程中分子質量逐漸減小。在降解過程中生成大分子自由基，空阻效應使大分子自由基較穩定，它們很難在分子鏈內遷移，也不易進行分子間的雙基復合反應，其主要反應趨勢是重排或歧化反應，主鏈斷裂后被穩定下來。這是明膠受γ射線輻照后，產生穩定性較好的自由基的機理。因此，穩定自由基含量可間接反應降解程度。

2.5 劑量率對輻照明膠特性的影響

不同劑量率輻照后明膠的特性黏度、凝膠強度和斷裂伸長率列于表2。由表2可見，未輻照明膠的特性黏度為47.5mL／g，輻照明膠的特性黏度在41～42mL／g范圍內，且鈷源2和加速器輻照后明膠的特性黏度相近，鈷源1輻照后明膠的特性黏度略低。未輻照明膠的凝膠強度為642.8g，輻照明膠的凝膠強度在560～590g范圍內，凝膠強度的大小依序為：鈷源2輻照后的明膠、加速器輻照的明膠和鈷源1輻照的明膠。未輻照明膠的斷裂伸長率為221.3%，輻照明膠的斷裂伸長率范圍為160%～200%，斷裂伸長率由大到小依序為鈷源2、加速器和鈷源1。

表2 劑量率對明膠特性的影響Table 2 Influence of dosage rate on property of gelatin

綜上所述，鈷源劑量率加大，有利于減少無水明膠蛋白的降解，保持較高的特性黏度、凝膠強度和明膠膜的斷裂伸長率。加速器輻照效果略次于鈷源2的輻照效果，但優于鈷源1的輻照效果。

有研究［3］表明，高劑量率輻照造成R·和ROO·的濃度相對較高時，自由基間的反應取代了自由基與完整分子間的反應，致使由·OH引發的鏈式反應蔓延過程受到限制，主要是鏈終止反應。相反在低劑量率時每個單位時間內幾乎均未形成脂質過氧自由基ROO·，而是與相鄰完整分子的反應導致鏈式反應被延長，故低劑量率對蛋白質產生更大程度的損傷。長壽命自由基對照后貯藏期明膠性能的影響有待進行深入、系統的研究。

2.6 劑量率對輻照明膠微觀結構的影響

圖6為未輻照明膠和吸收劑量約8kGy的明膠表面放大500倍的掃描電鏡圖像。由圖6可見：未輻照明膠表面有少量凹陷，且有明顯未溶解的顆粒狀物；三種輻照方式下，明膠表面孔洞數量較未輻照明膠均有所增加，但隨著劑量率的增加，孔洞變淺，且逐漸模糊。鈷源1輻照明膠表面孔洞稀疏、大、深，基質表面光滑，鈷源2和加速器輻照的明膠表面孔洞逐漸變得不明顯，且凸起物密集，尤其是加速器。對于孔洞，推測是明膠凝膠在冷凍干燥過程中水分揮發形成的通道。對于突起物，分析是由于明膠溶解性差，在水溶液中分布不均造成的。明膠經不同劑量率輻照相同劑量后，分解反應程度不同，水溶解性不同，分解程度越大，溶解性越好，則凸起物越少，基質越光滑。由6圖還可見，劑量率越大，明膠輻照分解越少，表面突起越多。

圖6 不同劑量率輻照明膠的SEM圖像Fig.6 SEM photographs of gelatin irradiated on different dosage rates

3 結論

1）未輻照明膠的ESR信號很弱，輻照明膠的ESR譜呈雙峰特征，峰高由高到低依次為：60Gy／min鈷源輻照的明膠、加速器輻照的明膠和480Gy／min鈷源輻照的明膠；

2）明膠的平均相對分子質量、特性黏度、凝膠強度、斷裂伸長率由大到小依次為：480Gy／min鈷源輻照的明膠、12 000Gy／min加速器輻照的明膠、60Gy／min鈷源輻照的明膠；

3）明膠的相對分子質量越小，水溶解性越好，SEM圖像表面越光滑，因此其表面粗糙程度由大到小的順序與平均相對分子質量的相同。

4）自由基濃度越高，輻射化學反應越激烈，性能劣變程度越大。高劑量率產生低濃度長壽命自由基，有利于減小輻射損傷，其作用機理可能是：瞬時高濃度自由基間反應增加而帶來自由基的淬滅，減少了自由基對主鏈分子的攻擊機會。具體機理有待進一步脈沖輻解研究加以佐證。

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Effect of Dose Rate on Radical and Property of Gelatin

GENG Sheng-rong，CHEN Yu-xia，ZU Xiao-yan，LI Xin，JIANG Hong－you
（Institute for Farm Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China）

The gelatin was irradiated respectively in the range of 0-32kGy by dose rates of 60Gy／min60Co，480Gy／min60Co and 12 000Gy／min accelerator，and the relationships of the radical character and gelatin property with dose rate were investigated through electron spin resonance（ESR）and gelatin permeation chromatogram.The results show that there is weak ESR signal from unirradiated gelatin，but irradiated one presents typical double peak.The order of ESR signal intensity of gelatin with the same absorbed dosage from high to low is 60Gy／min60Co，480Gy／min60Co and 12 000Gy／min accelerator.The linear relationship between ESR signal intensity from60Co irradiated gelatin and absorbed dose is y＝26.983x2＋1 641.8x－205.69.The intrinsic viscosity，average relative molecular weight，gelatin strength and breaking elongation of irradiated gelatin from high to low are 480Gy／min60Co，12 000Gy／min accelerator and60Gy／min60Co.The protection mechanism of high dose rate radiation on gelatin degradation is that the production of effective long life free radicals reduces.

gelatin；irradiation；accelerator；dosage rate

TL99；TS522

：A

：1000-6931（2015）04-0597-07

10.7538／yzk.2015.49.04.0597

2013-12-19；

2014-05-28

國家自然科學基金資助項目（11105048）；湖北省農業科學院青年科學基金資助項目（2014NKYJJ23）

耿勝榮（1979—），女，湖北紅安人，副研究員，碩士，從事高分子輻射改性及機理研究