MMP-2和MMP-9在新疆哈薩克族食管癌中的表達(dá)及意義

孫曉宏，蔣威華，李卉，尹娜，李惠武(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科;基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心，烏魯木齊8300)

MMP-2和MMP-9在新疆哈薩克族食管癌中的表達(dá)及意義

孫曉宏1，蔣威華1，李卉2，尹娜2，李惠武2
(新疆醫(yī)科大學(xué)1附屬腫瘤醫(yī)院胸外科;基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心，烏魯木齊830011)

目的探討MMP-2和MMP-9 mRNA在新疆哈薩克族食管鱗癌及其癌旁組織中的表達(dá)及二者的相關(guān)性。方法選取食管癌手術(shù)離體標(biāo)本40例，每例各取癌組織和對應(yīng)的癌旁組織一份，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(RT-PCR法)檢測MMP-2和MMP-9mRNA在癌及癌旁組織組中的表達(dá)。運用Western-blot法檢測MMP-2和MMP-9在癌及癌旁組織組中的蛋白表達(dá)。采用Pearson相關(guān)分析法分析MMP-2和MMP-9mRNA在癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果MMP-2mRNA在癌組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為95.0%(38/40)和77.5%(31/40)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.165，P=0.023);MMP-9mRNA在癌組織和癌旁組織中的陽性率分別為62.5%(25/40)和10.0%(4/40)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.854，P=0.000)。MMP-2mRNA的表達(dá)與食管鱗癌浸潤深度有關(guān)聯(lián)(χ2=5.260，P=0.022)，與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)(χ2=0.088，P=0.767)。MMP-9mRNA的表達(dá)與食管鱗癌浸潤深度有關(guān)(χ2=4.365，P=0.037)，與食管鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)(χ2=0.156，P=0.693)。MMP-2 mRNA與MMP-9 mRNA在食管鱗癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.327，P=0.039)。結(jié)論MMP-2和MMP-9可能參與了新疆哈薩克族食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤發(fā)生發(fā)展，但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面可能不發(fā)揮關(guān)鍵作用。

食管鱗狀細(xì)胞癌;基質(zhì)金屬蛋白酶-2;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

食管癌是全球位列第8的惡性腫瘤，在全球癌癥死亡原因中位列第6。2008年全球有482 300人被診斷患有食管癌，有406 800人死于食管癌［1］。2003-2007年我國食管癌發(fā)病率為19.24/10萬，在癌癥發(fā)病構(gòu)成中排列第6位，同期食管癌死亡率為15.39/10萬，在癌癥死亡原因中列第4位［2］。中國食管癌發(fā)病占全球的53.8%，死亡占全球的51.9%［3］。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellularmatrix，ECM)的降解密切相關(guān)［4］。ECM由多種蛋白裂解酶降解，其中就包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。國外鮮有關(guān)于MMP與食管癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究，國內(nèi)對于MMP的研究多采用免疫組織化學(xué)法，且多是單獨針對MMP中某一單一基因的研究，本研究應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測MMP-2和MMP-9基因在食管癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中的表達(dá)情況，同時運用Western-blot技術(shù)在蛋白水平予以驗證，在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平探討兩者在食管癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，同時探討兩者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2009年12月-2011年9月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行根治性切除的新疆哈薩克族手術(shù)標(biāo)本40例，每例標(biāo)本分別取癌組織及其相應(yīng)癌旁組織各一份，液氮冷凍后-80℃冰箱儲存留待檢測。40例均為經(jīng)病理證實的食管鱗狀細(xì)胞癌，男性72例，女性28例。年齡最小37歲，最大80歲，中位年齡57.4歲。根據(jù)食管癌TNM2009第7版分期標(biāo)準(zhǔn)，T1+T2期16例，T3+T4期24例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。高、中分化和低分化的分別有29和11例。

1.2 主要試劑和設(shè)備實驗所用Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒分別購自Invitrogen公司、Promega公司和上海生物工程有限公司;其他實驗試劑，如溴化乙錠(EB)、瓊脂糖、氯仿、無水乙醇、異戊醇和異丙醇等由新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院科研中心提供。PCR擴(kuò)增儀為美國Bio-Rad公司的生產(chǎn)的Icycler型，DC2000凝膠成像分析儀也來自美國Bio-Rad公司。

1.3 提取組織標(biāo)本中的總RNA的及濃度檢測按照Trizol試劑盒的操縱規(guī)程提取組織標(biāo)本總RNA，于紫外分光光度計下分別測定1μg所提RNA在260和280 nm處的吸光度(A)A260和A280值，計算A260/A280值，使其在1.8～2.1之間以保證所提取的RNA的濃度和純度。取5μL的RNA于1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，凝膠成像分析儀觀察提取RNA的18S和28S條帶，確保所提RNA的質(zhì)量。

1.4 合成互補(bǔ)DNA(cDNA)在1μL總RNA標(biāo)本中分別加1μL引物和9μL雙蒸水，將其混勻后72℃恒溫溫浴10 min后取出，將混合液置于冰上，依次加2μL dNTP、4μL MgCl2、0.5μLRNA酶抑制劑、2μL10倍緩沖液和0.5μL逆轉(zhuǎn)錄酶于其中后混勻，42℃恒溫1 h，95℃恒溫5 min，然后取出并放置在冰上，再加入80μL雙蒸水于其內(nèi)使最終逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物體積為100μL。

1.5 配制PCR反應(yīng)體系及PCR反應(yīng)向6μL雙蒸水中依次加入目的基因正、反向引物各1μL和2倍濃度的PCR試劑盒反應(yīng)液10μL，再加2μL已合成的cDNA加入其中，使PCR反應(yīng)體系終體積為20 μL。各基因引物序列、產(chǎn)物大小及PCR反應(yīng)Tm值見表1。

表1 GAPDH、MMP-2和MMP-9的引物序列和PCR反應(yīng)條件

1.6 判定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于5μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物內(nèi)加入1μL緩沖液(buffer)后將其在2%瓊脂糖凝膠上電泳，在DC2000凝膠成像分析儀下觀察目的基因條帶并保存成像圖像。在499 bp附近出現(xiàn)亮色條帶，則MMP-2表達(dá)陽性，否則為陰性;在308 bp附近出現(xiàn)亮色條帶，則MMP-9表達(dá)陽性，否則為陰性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，比較MMP-2和MMP-9在癌組織和癌旁組織中陽性表達(dá)的差異，分析MMP-2和MMP-9在癌組織組中的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 40例癌組織與癌旁組織MMP-2mRNA、MMP-9m RNA表達(dá)比較40例標(biāo)本中MMP-2mRNA在癌組織中陽性表達(dá)為95.0%(38/40)，在對應(yīng)癌旁正常組織中的陽性表達(dá)為77.5%(31/40)，兩者比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.165，P= 0.023)，MMP-2mRNA在癌組織中的表達(dá)較其在癌旁正常組織中的表達(dá)高;MMP-9mRNA在癌組織中陽性表達(dá)為62.5%(25/40)，在對應(yīng)癌旁正常組織中的陽性表達(dá)為10.0%(4/40)，兩者比較差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.854，P=0.000)，MMP-9mRNA在癌組織中的表達(dá)較其在癌旁正常組織中的表達(dá)高，見圖1。

圖1 MMP-2m RNA、MMP-9m RNA及GAPDHm RNA基因PCR電泳圖

2.2 食管癌組織中MMP-2和MMP-9m RNA的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理因素的關(guān)聯(lián)MMP-2和MMP-9mRNA的表達(dá)與腫瘤浸潤深度有關(guān)聯(lián)，與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、患者的性別、年齡和腫瘤分化程度均無關(guān)聯(lián)(P＞0.05)，見表2。

表2 MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系

2.3 食管癌組織中MMP-2mRNA和MMP-9mRNA的表達(dá)經(jīng)Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，MMP-2mRNA與MMP-9mRNA呈正相關(guān)(r=0.274，P=0.006)，結(jié)果見表3。

表3 MMP-2mRNA和MMP-9mRNA在40例哈薩克族食管鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

MMPs是一類能夠降解ECM和基底膜組分的蛋白水解酶，其家族成員目前發(fā)現(xiàn)已超過20個，蛋白水平根據(jù)各自降解底物的特異性和自身結(jié)構(gòu)的不同分為膠原酶、間質(zhì)溶解素和明膠酶。關(guān)于MMP-2在各種腫瘤組織及正常組織內(nèi)的表達(dá)情況有多位學(xué)者進(jìn)行了研究，因所采用的研究方法不同，所以其研究結(jié)果不盡相同，甚至有些結(jié)果是截然相反的。李秀梅等［4］采用RT-PCR法對食管癌中MMP-2的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn):MMP-2在食管癌組織中的表達(dá)較正常組織增高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。多位學(xué)者采用免疫組化法對食管癌中MMP-2的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn):MMP-2蛋白在食管癌中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織［5-8］。本研究結(jié)果顯示:MMP-2 mRNA的表達(dá)在癌組織中均明顯高于癌旁正常組織，并且MMP-2 mRNA的表達(dá)與腫瘤侵潤深度有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為MMP-2在食管癌發(fā)生和浸潤性生長過程中發(fā)揮了重要作用。Hong等［9］和Koskensalo等［10］應(yīng)用免疫組化法對結(jié)直腸癌中MMP-2的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。Hwang等［11］應(yīng)用免疫組化法對胃癌中MMP-2的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。董紹安等［12］和于維娜［13］應(yīng)用免疫組化法對食管癌中MMP-2的表達(dá)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP-2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān);本研究結(jié)果顯示:MMP-2的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)，與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為MMP-2在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面不發(fā)揮關(guān)鍵作用。

近年研究顯示:MMPs在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤浸潤有關(guān)聯(lián)，如在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn):MMP-9在癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常胃黏膜組織，且MMP-9的表達(dá)與胃癌浸潤深度有關(guān)［14-15］; Chen等［16］對食管癌的研究表明，PLGF促進(jìn)食管癌的轉(zhuǎn)移是通過對MMP-9的激活實現(xiàn)的。Li等［17］研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)孢菌素A/MMP-9信號通路有助于食管癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。有關(guān)食管癌的研究也發(fā)現(xiàn): MMP-9在癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織，且其表達(dá)與食管癌浸潤深度有關(guān)聯(lián)［18］。本研究結(jié)果顯示:MMP-9 mRNA表達(dá)在癌組織中均明顯高于癌旁正常組織，并且其表達(dá)與腫瘤浸潤深度有關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果與上述各研究結(jié)論一致，故認(rèn)為MMP-9在食管癌發(fā)生及浸潤性生長過程中發(fā)揮了重要作用。Koskensalo等［19］應(yīng)用免疫組化法對結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn):MMP-9的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)。Durlik等［20］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對胰腺癌的研究發(fā)現(xiàn):MMP-9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)。Oshima等［21］應(yīng)用RT-PCR法對結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn): MMP-9與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)。Lu等［22］應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對食管癌的研究發(fā)現(xiàn):MMP-9與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示:MMP-9的表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)聯(lián)，結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，故認(rèn)為MMP-9在食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面不發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究結(jié)果顯示:MMP-2與MMP-9 mRNA之間呈正相關(guān)關(guān)系，說明MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA的表達(dá)之間起著相互促進(jìn)的作用，可能相互協(xié)同促進(jìn)新疆哈薩克族食管癌的發(fā)生及進(jìn)展。

綜上所述，食管癌的發(fā)生發(fā)展不是個單一基因控制的反應(yīng)過程，本研究結(jié)果顯示:MMP-2和MMP-9可能促進(jìn)了食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生，同時可能增強(qiáng)了食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤生長能力。MMP-2和MMP-9與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能均無關(guān)聯(lián)。MMP-2和MMP-9表達(dá)水平的上調(diào)可能是食管癌發(fā)病的機(jī)制之一，對MMP-2和MMP-9的聯(lián)合檢測可評價新疆哈薩克族食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤生長程度，并為進(jìn)一步闡明其發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供了實驗依據(jù)。

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Expression and significance of MMP-2and MMP-9 in Kazakh patients with esophageal squamous cell carcinoma in Xinjiang

SUN Xiaohong1，JIANG W eihua1，LIHui2，YIN Na2，LIHuiwu2
(1Surgical Department of Thorax，Affiliated Tumor Hospital;2Research Center of Basis Academy，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Ob jective To study the expression and correlation of MMP-2 and MMP-9 mRNA in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissues of Kazakh patients in Xinjiang.Methods 40 histopathologicallyconfirmed esophageal cancer and an equal number of corresponding adjacent tissue biopsieswere analyzed for the expression ofMMP-2 and MMP-9mRNA in esophageal squamous cell carcinoma and adjacent tissueswith RT-PCR method.Western-blotwas used to detect the expression of protein ofMMP-9 and MMP-2 in the cancer tissues and corresponding adjacent tissues.The Pearson correlation analysiswas used to analyze the correlation between MMP-9 and mRNA MMP-2 expression in cancer tissues.Results Positive rates of MMP-2mRNA expression in cancer tissues and corresponding adjacent tissueswere 95.0%(38/40)and 77.5%(31/40)respectively，and the differencewas statistically significant(χ2=5.165，P=0.023);Positive rates of MMP-9 mRNA in cancer tissues and corresponding adjacent tissueswere 62.5%(25/40)and 10.0%(4/40)，which was also statistically significant(χ2= 23.854，P=0.000).The expression ofMMP-2mRNA was correlated with the depth of invasion ofesophageal squamous cell carcinoma(χ2=5.260，P=0.022)but had no association with the lymph nodemetastasis of esophageal squamous cell carcinoma(χ2=0.088，P=0.767).The expression of MMP-9 mRNA was correlated with the depth of invasion of esophageal squamous cell carcinoma(χ2=4.365，P=0.037)，but there was no association with lymph node metastasis(χ2=0.156，P=0.693).The expression of mRNA MMP-9 and mRNA MMP-2 in esophageal squamous cell carcinoma was positively correlated(r=0.327，P=0.039).Conclusion MMP-2 and MMP-9 may be involved in the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma in Kazakh patients butmay not play a key role in the lymph nodemetastasis.

esophageal squamous cell carcinoma;matrixmetalloproteinase-2;matrixmetalloproteinase-9;reverse transcription-polymerase chain reaction

R735.1

A

1009-5551(2015)06-0691-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.008

2014-11-13］

(本文編輯張巧蓮)

國家自然科學(xué)基金(81350021)

孫曉宏(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向:胸部腫瘤外科診治。

李惠武，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:食管癌基礎(chǔ)研究，E-mail:huiwuli1234@163.com。