應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤染色體異常的研究

劉穎，王蕾，王新有，孫明玲，郭新紅(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心，烏魯木齊830054)

應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤染色體異常的研究

劉穎，王蕾，王新有，孫明玲，郭新紅
(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心，烏魯木齊830054)

目的探討應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)檢測多發(fā)性骨髓瘤(MM)的常見基因異常。方法收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2010年1月-2013年12月初治的16例MM患者的骨髓標(biāo)本，應(yīng)用FISH技術(shù)對1q2l擴(kuò)增、RB1缺失、D13S319缺失、p53缺失及IGH重排5種染色體異常進(jìn)行檢測，并與常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法(CC)進(jìn)行比較。結(jié)果16例MM患者中應(yīng)用FISH技術(shù)檢測出染色體異常為9例(56.25%)，CC的染色體異常檢出率僅為20%(2/10)。FISH技術(shù)中IGH重排陽性率為43.75%(7/16)，RB1缺失5例(31.25%)，lq21擴(kuò)增2例(12.5%)，D13S319缺失2例(12.5%)，p53缺失1例(6.25%)。β2-MG與IGH重排、p53缺失呈正相關(guān)(P＜0.05)，骨髓漿細(xì)胞增多與IGH易位及D13S319缺失呈正相關(guān)(P＜0.05)。染色體異常與患者的性別、年齡、M蛋白類型、分期、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血鈣、C-反應(yīng)蛋白(CRP)均無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論MM最常見的基因異常是IGH重排及13q缺失;p53缺失的發(fā)生率較低。FISH技術(shù)對于MM染色體異常的檢出率高于常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法。

熒光免疫雜交技術(shù);多發(fā)性骨髓瘤;常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法

多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，MM)是一種較常見的好發(fā)于中老年的漿細(xì)胞單克隆惡性增殖的血液系統(tǒng)腫瘤。最近的研究顯示，MM發(fā)生基因與染色體異常的概率很高且常常具有獨(dú)立的預(yù)后判斷價(jià)值［1］。但是常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法(conventional cytogenetics，CC)對異常染色體的檢出率比較低，隨著熒光原位雜交(Fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)的不斷進(jìn)展，明顯提高了MM的染色體異常的檢出率，推進(jìn)了MM的細(xì)胞遺傳學(xué)研究，同時(shí)還具有操作簡便、重復(fù)性好及特異性高等優(yōu)點(diǎn)。本研究同時(shí)采用CC及FISH技術(shù)檢測16例初治多發(fā)性骨髓瘤患者的染色體，對2種檢測方法進(jìn)行比較，旨在為臨床評估預(yù)后提供依據(jù)，也為實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2010年1月-2013年12月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的初治MM患者16例，其中男性11例，女性5例，年齡39～78歲，中位年齡59歲。所有病例均經(jīng)骨髓形態(tài)學(xué)、免疫分型和免疫固定電泳確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》［2］。根據(jù)Durie-Salmon分期和國際分期系統(tǒng)(international staging system，ISS)進(jìn)行分期［3］。按Durie-Salmon分期:Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期12例。免疫球蛋白類型:IgG型9例(56.25%)，IgA型2例(12.5%)，κ輕鏈型1例(6.25%)，λ輕鏈型2例(12.5%)，不分泌型2例(12.5%)。

1.2 常規(guī)染色體分析采集肝素抗凝的骨髓標(biāo)本，用不加有絲分裂原刺激劑的24 h培養(yǎng)法制備染色體標(biāo)本，G-顯帶進(jìn)行染色體核型分析，每例至少分析20個(gè)中期分裂相。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制(ISCN1995)》識別及分析核型異常。

1.3 FISH檢測

1.3.1 標(biāo)本制備及探針儀器的選擇用肝素鈉抗凝管采集患者骨髓標(biāo)本，細(xì)胞經(jīng)分離、洗滌、低滲、固定、滴片處理后室溫下過夜。位點(diǎn)特異性探針(1ocus speeifie prober，LSI)lq21、RB1、D13S319、p53、IGH均購自北京金菩嘉公司。lq21探針用于檢測1號染色體長臂的異常，RB1探針檢測13號染色體RB1位點(diǎn)缺失，p53探針檢測17號染色體短臂的缺失，D13S319探針檢測13q14.3缺失，IGH探針檢測14q32易位。按照探針試劑的說明書進(jìn)行DNA變性、雜交、洗片及復(fù)染。用Olympus BX51熒光顯微鏡進(jìn)行圖形采集，VideoTest Fish2.0系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

1.3.2 正常閾值的建立采集10例健康人的骨髓標(biāo)本，采用lq21/RB1、D13S319/p53、IGH3組LSI進(jìn)行FISH檢測。分析10例健康對照骨髓單核細(xì)胞標(biāo)本的200個(gè)間期細(xì)胞，計(jì)算出y陽性信號細(xì)胞百分比的均值及標(biāo)準(zhǔn)差(s)，用(±3s)定義為正常閾值。

1.3.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)D13S319探針在正常間期細(xì)胞中表現(xiàn)為2個(gè)紅色熒光信號，只有1個(gè)紅色信號為異常;RB1探針和p53探針在正常間期細(xì)胞中表現(xiàn)為2個(gè)綠色熒光信號，只有1個(gè)綠色熒光信號為異常;lq21探針在正常間期細(xì)胞中表現(xiàn)為2個(gè)紅色熒光信號，出現(xiàn)3個(gè)或3個(gè)以上紅色熒光信號為異常;IGH探針在正常間期細(xì)胞中出現(xiàn)2個(gè)紅色和綠色信號融合而成的黃色熒光信號，出現(xiàn)兩紅兩綠或一紅一綠一黃判斷為異常(圖1)。如果檢測值大于正常閾值，則判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組率的比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析用分類變量的關(guān)聯(lián)性分析及Spearman秩相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 探針信號異常

2 結(jié)果

2.1 正常閾值正常對照組1q21的閾值為5.1%，RB1的閾值為6.2%，D13S319的閾值為7.7%，p53的閾值為5.5%，IGH的閾值為3.7%。

2.2 常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果16例MM患者中6例(37.5%)因細(xì)胞數(shù)少或無分裂象未成功進(jìn)行核型分析，有分裂象的10例(62.5%)中2例(20%)檢測出存在染色體異常，其余8例均為正常核型。異常核型檢出率為20%。

2.3 FISH檢測結(jié)果16例MM患者中9例(56.25%)檢測出不同類型的基因異常。其中IGH基因重排7例(43.75%)，RB1缺失5例(31.25%)，lq21擴(kuò)增2例(12.5%)，D13S319缺失2例(12.5%)，p53缺失1例(6.25%)。9例檢出染色體異常患者中，1種異常者3例(18.75%)，2種異常者4例(25%)，3種異常者2例(12.5%)，未檢出4種及5種染色體異常同時(shí)發(fā)生的情況。檢出2種及以上異常占所有患者的43.75%，占可檢出異常者的77.8%。CC異常染色體的檢出率為20%，應(yīng)用FISH技術(shù)的檢出率為56.25%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 FISH檢測結(jié)果與臨床相關(guān)因素分析5種染色體異常與患者的性別、年齡、M蛋白類型、分期、血細(xì)胞計(jì)數(shù)、血鈣、CRP均無相關(guān)性(P＞0.05)。β2-MG與IGH重排、p53缺失呈正相關(guān)(P＜0.05)，與lq21、RB1、D13S319基因異常無相關(guān)性(P＞0.05)。骨髓漿細(xì)胞增多與IGH易位及D13S319缺失呈正相關(guān)(P＜0.05)，與lq21、RB1、p53、IGH異常無相關(guān)性(P＞0.05)。伴有1q21擴(kuò)增及p53基因缺失的MM患者死亡率明顯高于陰性組(P＜0.05)，伴有IGH易位及del(13ql4)MM患者死亡率與陰性組患者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 染色體異常與臨床因素相關(guān)性

3 討論

MM患者幾乎均存在分子遺傳學(xué)異常，MM染色體核型多變而且非常復(fù)雜，一般表現(xiàn)為染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的異常。CC對染色體異常的檢出率較低，這與骨髓瘤細(xì)胞比例低、體外有絲分裂指數(shù)低、中期分裂相少且多為正常分裂相等因素有關(guān)。然而FISH技術(shù)可以通過預(yù)先設(shè)定特異的基因探針來識別染色體異常，并且可以使用未培養(yǎng)的間期細(xì)胞，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，同時(shí)也很大程度地縮短了檢測時(shí)間。但是FISH技術(shù)也存在無法檢測出未知染色體的缺陷。本研究同時(shí)應(yīng)用CC和FISH技術(shù)檢測16例MM患者的染色體核型，其異常染色體的檢出率分別為20%和56.25%，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示，當(dāng)同時(shí)運(yùn)用2種檢測手段檢測同一種染色體異常時(shí)，F(xiàn)ISH技術(shù)體現(xiàn)出了其具有更高的檢出率，和更為敏感、可靠的優(yōu)越性。

IGH基因(14q32)易位是MM發(fā)病的第一步，同時(shí)也是MM最常見的基因異常，而13q缺失和1q2l擴(kuò)增較IGH易位少見［4-5］。本研究FISH檢測結(jié)果顯示:16例MM患者14q32重排為43.75%(7/ 16)，del(13q14)的陽性率也為43.75%(7/16)，其次1q21為12.5%(2/16)，最少見為p53缺失，陽性率為6.25%(1/16)。本研究顯示，在MM的染色體異常中，IGH易位和13q缺失最常見，而1q2l擴(kuò)增及p53缺失較少見，這與Steward等［6］報(bào)道的結(jié)果基本一致。

MM患者存在l號染色體異常往往提示疾病預(yù)后差、生存期短［7］。Chang等［8］對203例初治MM患者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)有36例患者存在lp21缺失，lp21和lq21密切相關(guān)，是預(yù)后不良的因素。但是大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)存在t(11;14)的患者預(yù)后較好，伴有t (4;14)的患者預(yù)后較差。因此認(rèn)為lq21并不是MM的獨(dú)立預(yù)后因素，其對預(yù)后的影響主要是由于lq21與t(4;14)等其他不良預(yù)后因素相關(guān)而造成的［9］。本研究結(jié)果顯示lq21發(fā)生率為12.5%，低于國際報(bào)道，還發(fā)現(xiàn)1q21擴(kuò)增與MM患者死亡率相關(guān)，但由于病例數(shù)較少，關(guān)于1q21擴(kuò)增是否是MM的獨(dú)立預(yù)后因素還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大病例數(shù)證實(shí)。有研究指出p53缺失在MM中發(fā)生率很低，一旦出現(xiàn)則提示疾病晚期預(yù)后不良［10］。p53基因位于17號染色體的短臂，是與細(xì)胞周期相關(guān)的抑癌基因。研究顯示p53基因缺失可能是導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生的原因，但其在血液系統(tǒng)腫瘤中突變率較低。在本研究中p53缺失最少見，陽性率僅為6.25%(1/16)，低于Schop等［11］和Chang等［12］報(bào)道，考慮可能與本組病例數(shù)較少相關(guān)，可進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)樣本量來驗(yàn)證。本研究還顯示同時(shí)檢出2個(gè)及2個(gè)以上基因異常占所有異常的77.8%，說明大多數(shù)MM病例可同時(shí)涉及多個(gè)基因異常。

骨髓瘤細(xì)胞可以分泌β2-MG并釋放入血，因此高水平的β2-MG往往提示腫瘤負(fù)荷高，也是提示預(yù)后不良的因素。本研究顯示，β2-MG與IGH重排、p53缺失呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此說明IGH重排及P53缺失可能是MM的不良預(yù)后因素。

總之，應(yīng)用FISH技術(shù)可顯著提高M(jìn)M患者細(xì)胞分子遺傳學(xué)異常的檢出率，對于初治MM患者需常規(guī)進(jìn)行FISH檢測，可了解其基因異常，對預(yù)后進(jìn)行評估，為指導(dǎo)臨床選擇個(gè)體化治療方案提供依據(jù)。所以應(yīng)將FISH作為常規(guī)檢查在臨床上廣泛推廣應(yīng)用。但MM的染色體異常多為復(fù)雜核型異常，故FISH檢測技術(shù)有其一定局限性，并不能取代常規(guī)的檢測手段，進(jìn)行研究時(shí)可考慮聯(lián)合多種方法進(jìn)行檢測。

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Fluorescence in situ hybridization technology in the study ofmultip lem yelom a

LIU Ying，WANG Lei，WANG Xinyou，SUN Mingling，GUO Xinhong
(Department of Hematology Centre，the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi830054，China)

Objective To explore the common genetic abnormalities in the patientswithmultiplemyeloma(MM) by fluorescence in situ hybridization(FISH).Methods 16 caseswith MMtreated in the First Affiliated Hospital to Xinjiang Medical University in 2010.1-2013.12 were collected.Interphase fluorescence in situ hybridization was adopted to detect lq21 amplification，RBl deletion，Dl3S319 deletion，p53 deletion and IGH rearrangement.The difference in chromosomal abnormalitieswas compared by FISH and other conventional cytogenetics.Resu lts Nine of the 16 patientswere detected chromosomal abnormalities by FISH and the detection rate of the conventional chromosome examination was 20%only.The positive rates of 14q32，del(13q14)，1q21，and p53 by FISH were 43.75%(7 in 16)，43.75%(7 in 16)，12.5%(2 in 16)and 6.25%(1 in 16).Compared with clinical factors，genetic abnormalities showed thatβ2-MG in IGH abnormal and p53 deletion patients were significantly higher than others(P＜0.05).Patients with increasing bone marrow cells of 14q32 and p53 deletion were higher than those without such abnormalities(P＜0.05).No significant difference was observed in the relationship between chromosome aberration and sex，age，stage，blood corpuscle，blood calcium and CRP.Conclusion It proved that the most common genetic abnormalities in MMwas IGH rearrangement and del(13q14)，with lower occurrence rate of p53 deletion.MMdetection rate of chromosomal abnormalities by FISH was significantly superior to the traditional methods.

fluorescence in situ hybridization;multiplemyeloma;conventional cytogenetics

R446;R733

A

1009-5551(2015)06-0725-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.016

2014-06-22］

(本文編輯周芳)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C043)

劉穎(1983-)，女，碩士，住院醫(yī)師，研究方向:血液系統(tǒng)惡性腫瘤。

郭新紅，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向:血液系統(tǒng)惡性腫瘤，E-mail:guoxinhong222@sina.cn。