HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

方芳，胡爾西旦·尼牙孜，武貴臻，阿布力孜·阿布杜拉，盛磊(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊80054;新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊800)

HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

方芳1，胡爾西旦·尼牙孜2，武貴臻3，阿布力孜·阿布杜拉3，盛磊3
(新疆醫(yī)科大學(xué)1第一附屬醫(yī)院婦科，2第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊830054;3新疆地方病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011)

目的構(gòu)建人乳頭瘤病毒(HPV)E6、E7基因慢病毒真核表達(dá)載體。方法以SiHa宮頸癌細(xì)胞總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出E6、E7目的片段;選用病毒載體pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit系統(tǒng)構(gòu)建E6、E7基因慢病毒真核表達(dá)載體;分別使用構(gòu)建好的E6、E7載體轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞，獲得含病毒的上清液，并測定上清液中慢病毒的滴度。結(jié)果質(zhì)粒測序所得序列與人乳頭瘤病毒E6、E7基因序列完全吻合，載體構(gòu)建成功;慢病毒滴度測定結(jié)果顯示E6樣品的慢病毒滴度為1.5×108TU/mL，E7樣品的慢病毒滴度為2×108TU/mL，該滴度能夠滿足后續(xù)研究所需。結(jié)論HPV-16 E6、E7基因慢病毒真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以為進(jìn)一步研究人乳頭瘤病毒E6、E7基因致病機(jī)理奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

宮頸癌;HPV16;E6、E7基因;慢病毒載體

人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus HPV)是一種環(huán)狀雙鏈DNA病毒，長約8 kb，由72個病毒殼粒包被，穩(wěn)定性好，廣泛分布于自然界中。該病毒具有嗜上皮性，通過微創(chuàng)口侵入皮膚黏膜表層，進(jìn)而感染基底層細(xì)胞。病毒的增殖依賴于上皮細(xì)胞的分化，并在鱗狀上皮細(xì)胞中被復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。HPV病毒種類達(dá)100多種，根據(jù)其致病程度與癌癥轉(zhuǎn)化能力分為高危型、中危型和低危型等3種類型。HPV-16、HPV-18、HPV-45和HPV-56等屬于高危型，在宮頸癌標(biāo)本中的檢出率達(dá)80%［1-4］。研究發(fā)現(xiàn)高危型HPV編碼的E6或E7蛋白可以影響宿主細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期控制機(jī)制，促進(jìn)細(xì)胞增長與繁殖［5-7］;單純E6、E7基因的表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞生長與繁殖的影響不同［8］。因此，本研究通過應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建HPV-16 E6、E7基因的慢病毒真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究HPV-16 E6、E7基因致癌機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit(Invitrogen)，QuickTiterTMLentivirus Titer Kit(Cell BioLabs)，青霉素/鏈霉素(Sigma)，Geneticin(Sigma)，DMEM培養(yǎng)基(Gibico)，F(xiàn)BS (Gibico)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Pfu酶PCR試劑盒(Fermentas)，高效制備感受態(tài)細(xì)胞試劑盒(生工生物工程公司)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及高純度質(zhì)粒提取試劑盒(天根生化公司)。實(shí)驗(yàn)中使用的SiHa細(xì)胞株來自于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得使用TRIzol法提取HPV-16陽性SiHa宮頸癌細(xì)胞株的總RNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit試劑盒引物設(shè)計要求設(shè)計并合成引物(引物序列見表1)，以cDNA為模板，使用Pfu酶PCR試劑盒合成目的基因E6、E7片段，并用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 目的基因的引物序列

1.2.2 目的基因的純化使用瓊脂糖凝膠回收純化法對目的DNA進(jìn)行純化(具體操作參照大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒使用說明書)，并利用快速核酸/蛋白分析儀對回收所得DNA濃度進(jìn)行測定。

1.2.3 感受態(tài)大腸桿菌制備使用CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞(具體操作參照高效制備感受態(tài)細(xì)胞試劑盒使用說明書)，分裝投入液氮速凍后，-70℃保存。

1.2.4 重組DNA的導(dǎo)入將純化后的PCR產(chǎn)物4μL、Salt Solution 1μL、TOPO vector(藍(lán)色示正常) 1μL混合為TOPO Mix，22℃孵育30 min。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，并使用ampicillin進(jìn)行抗生素篩選(100μg/mL)，從而獲得陽性克隆。

1.2.5 E6、E7基因慢病毒載體的獲取及鑒定挑取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增，使用高純度質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，利用快速核酸/蛋白分析儀測量所提取質(zhì)粒DNA的濃度及純度。以質(zhì)粒DNA為模板，PCR擴(kuò)增E6、E7基因。最后送測序進(jìn)行鑒定。

1.2.6 慢病毒的包裝和獲取使用含10%FBS、1%青霉素/鏈霉素和500μg/mL Geneticin的DMEM(高糖)完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)293FT細(xì)胞。分別使用構(gòu)建好的pLenti6/V5-E6和pLenti6/V5-E7聯(lián)合病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集含病毒的上清液，4℃、3 000 r/min離心15 min，并使用0.22μm濾膜進(jìn)行濾過除菌，最終將無菌的含病毒上清-80℃凍存。

1.2.7 慢病毒滴度測定使用QuickTiterTMLentivirus Titer Kit試劑盒，利用ELISA原理檢測慢病毒p24核心蛋白(具體操作步驟參照試劑盒說明書)。根據(jù)倍比稀釋p24蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及其在450 nm處的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算出待測樣品E6及E7中p24蛋白濃度，由于每個慢病毒顆粒(Lentiviral particle，LP)約含2 000分子p24蛋白，1ng p24蛋白相當(dāng)于1.25×107LPs，1 TU LP約為1 000個LPs，因此80 ng/m L p24蛋白相當(dāng)于106TU/ mL慢病毒。具體計算公式:病毒滴度=p24蛋白濃度÷80 ng/mL×106TU/m L×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的獲得及純化用特異性引物對E6、E7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在476 bp處和296 bp處分別可見2條明亮的條帶，即通過PCR已獲得了目的基因(圖1)。將E6、E7基因PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠純化回收后，使用快速核酸/蛋白分析儀測量的結(jié)果分別為:E6基因0.023μg/μL，260/280為1.798;E7基因0.023μg/μL，260/280為1.801。

圖1 E6、E7基因PCR產(chǎn)物

2.3 目的基因的連接及重組DNA的導(dǎo)入將含有重組DNA的大腸桿菌接種在固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后，可見數(shù)目不等的白色菌落，選取菌落密度合適的培養(yǎng)平板挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)增。

2.4 pLenti6/V5-E6載體的鑒定使用快速核酸/蛋白分析儀測得的pLenti6/V5-E6質(zhì)粒DNA濃度為0.746μg/μL，260/280 1.802。以質(zhì)粒DNA為模板PCR擴(kuò)增E6基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶較清晰。對質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)所連接的片段序列分別與E6基因序列完全一致(圖2)。

2.5 pLenti6/V5-E7載體的鑒定使用快速核酸/蛋白分析儀測得的pLenti6/V5-E7質(zhì)粒DNA濃度為0.757μL，260/280 1.778。以質(zhì)粒DNA為模板PCR擴(kuò)增E7基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的條帶較清晰。對質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)所連接的片段序列分別與E7基因序列完全一致(圖3)。

2.6 慢病毒滴度測定測得樣品E6中p24蛋白濃度為61 ng/ml，E7中p24蛋白濃度為83 ng/mL。根據(jù)公式計算，E6樣品的慢病毒滴度為1.5×108TU/ mL;E7樣品的慢病毒滴度為2×108TU/m L，該滴度能夠滿足后續(xù)研究所需。

圖2 pLenti6/V5-E6質(zhì)粒的鑒定

3 討論

宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著婦女的健康，其發(fā)病率僅次于乳腺癌［9］，在全球女性惡性腫瘤中位居第2位。我國宮頸癌發(fā)病率高，每年有近15萬新發(fā)病例［10］。新疆維吾爾族婦女宮頸癌屬新疆特高發(fā)腫瘤，其發(fā)病率及死亡率均居全國第1位［11］。人乳頭瘤病毒(HPV)被公認(rèn)為宮頸癌發(fā)生的首要因素，其中又以高危型HPV-16感染與宮頸鱗癌關(guān)系最為密切。以往的研究顯示，HPV與TK1、SPP1、HLA-I、Smad4、Runx3、CALCA等宮頸癌相關(guān)的生物標(biāo)記物的表達(dá)變化有著密切的關(guān)系［12-16］。隨著近些年來人們對HPV不斷地研究，已初步揭示了HPV致癌的分子機(jī)制，其中E6、E7蛋白被認(rèn)為是HPV致癌的關(guān)鍵分子［18］。HPV基整合入宿主細(xì)胞基因組后，病毒E6、E7基因與細(xì)胞基因之間的復(fù)雜聯(lián)系有待于進(jìn)一步的研究。因此，成功構(gòu)建HPV-16 E6、E7基因的真核表達(dá)載體，使之成為細(xì)胞水平研究HPV-16 E6、E7基因致癌機(jī)制的工具，對全面而深入地揭示HPV-16 E6、E7基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用具有極其重要意義。

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1(HIV-1)為來源的一種病毒載體，它包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞。對于一些較難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、不分化的細(xì)胞等，使用慢病毒載體，能大大提高目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，且目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組的概率大大增加，能夠比較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因的長期、穩(wěn)定表達(dá)。

圖3 pLenti6/V5-E7質(zhì)粒的鑒定

在載體構(gòu)建過程當(dāng)中，目的基因與質(zhì)粒載體的連接是一個非常關(guān)鍵的步驟，其直接影響著載體的轉(zhuǎn)化效率。本實(shí)驗(yàn)采用特殊的聚合酶鏈反應(yīng)特異引物連接法，而不使用酶切，設(shè)計引物時在上游引物的5’末端添加序列CACC，這4個堿基可與克隆載體的突出末端GTGG配對結(jié)合(對立的末端不匹配)，從而使得由PCR獲得的目的基因片段可被定向地連接到該載體上，連接率可達(dá)到90%以上。

本研究針對HPV-16 E6、E7致癌基因，以HPV-16陽性SiHa宮頸癌細(xì)胞株總RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出E6、E7目的基因，選擇pLenti6/V5慢病毒載體并利用定向TOPO克隆技術(shù)將目的基因正確地連接在該載體上，然后將重組DNA導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞293FT，通過抗生素篩選出陽性克隆，繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得大量陽性克隆。最終通過測序的方法對所構(gòu)建的HPV-16 E6、E7基因表達(dá)載體進(jìn)行鑒定。測序結(jié)果顯示，與Genebank中HPV-16 E6、E7基因原序列相比，載體中的插入序列與之完全相同，說明載體構(gòu)建成功。使用慢病毒p24核心蛋測定法測定慢病毒滴度，結(jié)果顯示E6、E7病毒上清液中慢病毒的滴度均能滿足后續(xù)研究所需。

綜上所述，以HPV-16 E6、E7基因?yàn)閷ο螅梅肿涌寺〖夹g(shù)成功構(gòu)建了HPV-16 E6、E7基因的慢病毒真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染病毒包裝細(xì)胞后獲取含病毒的上清，為進(jìn)一步研究HPV-16 E6、E7蛋白作用及致癌機(jī)制奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，對促進(jìn)新疆維吾爾族婦女宮頸癌疾病的研究有著積極的作用。

［1］Monsonego J.HPV infections and cervical cancer prevention.Priorities and new directions［J］.Gynecol Oncol，2005，96(3): 830-839.

［2］Wiley D，Masongsong E.Human papillomavirus:the burden of infection［J］.Obstet Gynecol Surv，2006，61(6 Suppl 1):S3-14.

［3］Munoz N，Bosch FX，de SanjoséS，et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer［J］.N Engl JMed，2003，348(6):518-527.

［4］拉萊·蘇祖克，彭玉華，周康，等.新疆不同民族宮頸癌發(fā)病趨勢分析［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2006，29(7):569-571.

［5］Jones EE，Wells SI.Cervical cancer and human papillomaviruses: inactivation of retinoblastoma and other tumor suppressor pathways［J］.Curr Mol Med，2006，6(7):795-808.

［6］Ferenczy A，F(xiàn)ranco E.Persistent human papillomavirus infection and cervical neoplasia［J］.Lancet Oncol，2002，3(1):11-16.

［7］Yamato K，F(xiàn)en J，KobuchiH，etal.Induction of cell death in human papillomavirus 18-positive cervical cancer cells by E6 siRNA［J］.Cancer Gene Ther，2006，13(3):234-41.

［8］DeFilippis RA，Goodwin EC，Wu L，et al.Endogenous human papillomavirus E6 and E7 proteins differentially regulate proliferation，senescence，and apoptosis in HeLa cervical carcinoma cells［J］.JVirol.2003，77(2):1551-1563.

［9］Thierry F，Benotmane MA，Demeret C，et al.A genomic approach reveals a novel mitotic pathway in pap illomavirus carcinogenesis［J］.Cancer Res，2004，64(3):895-903.

［10］孫寶勝，左雅芳，田琦，等.宮頸癌腔內(nèi)治療下評估靶區(qū)和危及器官的劑量與體積［J］.中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，2013，33 (1):66-67.

［11］尹燕娜，艾星子·艾里，丁巖.新疆維吾爾族宮頸癌發(fā)病特征及進(jìn)展［J］.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2012，21(5):404-405.

［12］阿娜古麗·阿巴白克力，哈尼克孜·吐爾遜，阿布力孜·阿布杜拉，等.維吾爾族婦女宮頸癌及HPV感染與多種基因表達(dá)上調(diào)的關(guān)系［J］.科技導(dǎo)報，2012，30(19):50-54.

［13］阿仙姑·哈斯木，李巧稚，馬俊旗，等.維吾爾族患者宮頸病變中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和HLA-Ⅰ類分子表達(dá)與HPV16感染的關(guān)系研究［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2011，27(2):102-105.

［14］李巧稚，阿提開姆·阿布都克熱木，王燕，等.子宮頸癌中Smad4和Runx3表達(dá)與HPV16感染的關(guān)系［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，28(10):1112-1115.

［15］盛磊，阿仙姑·哈斯木，劉開江，等.維吾爾族婦女宮頸病變病理進(jìn)程與降鈣素相關(guān)肽α表達(dá)的關(guān)系［J］.癌變.畸變.突變，2011，23(4):287-290.

［16］盛磊，馬麗，希爾扎提江·蘇來曼，等.宮頸癌中CALCA基因甲基化與HPV16-E7致癌蛋白表達(dá)的依存關(guān)系［J］.科技導(dǎo)報，2014，32(10):63-67.

［17］卞繼峰，孔北華.人乳頭瘤病毒感染的致癌機(jī)制［J］.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2004，20(2):66-67.

Construction and identification of eukaryotic vector of HPV-16 E6，E7 genes

FANG Fang1，Huerxidan Niyazi2，WU Guizhen3，Abulizi Abudula3，SHENG Lei3
(1Department of Gynaecology，The First Afiliated Hospital，2Department of Tumor Center，The First Afiliated Hospital，Urumqi830054，China;3Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endemic Diseases，Xinjiang Medical University，Urumqi830011，China)

Objective To construct the eukaryotic expression vector for human papillomavirus(HPV)E6 and E7 genes.Methods We amplified the full-length HPV-16 E6 and E7 genes from the total RNA of the SiHa cell line by RT-PCR technique and sub-cloned the gene into pLenti6/V5 vector，which was identified and confirmed by DNA sequencing.The construction of E6 and E7 transfected viruses was used to package cells.Then we harvested viral supematantand determined the titer.Resu lts The plasmid sequencingwas completely consistentwith E6，E7 gene sequence，which showed that the vector was successfully constructed.The titer of E6 was 1.5×108TU/m L，and 2×108TU/m L of E7，satisfying the requirements of the subsequent researches.Conclusion The successful construction of HPV-16 E6 and E7 gene eukaryotic expression vector could lay thematerial foundation for furthering study of the pathogenesis of HPV E6 and E7 genes.

ervical cancer;HPV-16;E6，E7 genes;Lentivirus vector

R737.33

A

1009-5551(2015)06-0734-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2015.06.018

2014-11-03］

(本文編輯楊晨晨)

新疆維吾爾自治區(qū)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題基金(XJDX0208-2012-03);新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金(XJC201310)

方芳(1982-)，女，在讀碩士，研究方向:婦科腫瘤。

盛磊，女，實(shí)驗(yàn)師，研究方向:宮頸癌的發(fā)病機(jī)制與早期預(yù)警，E-mail:shenglei950505@163.com。