p16和CD44v6在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

摘要：目的 探討p16和CD44v6在胃癌中的表達(dá)規(guī)律及其臨床意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP方法，對(duì)93例胃癌中p16和CD44v6的表達(dá)進(jìn)行了觀察。結(jié)果 胃癌組織中p16和CD44v6蛋白的總陽(yáng)性率分別是39.78%（37/93）和41.94% （39/93）（P<0.05，P<0.05）。p16的表達(dá)與胃癌的分化程度和預(yù)后呈正相關(guān)，與胃癌TNM分期、浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。CD44v6的表達(dá)與胃癌的TNM分期、浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。p16和CD44v6的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.476，P=0.007）。結(jié)論 p16和CD44v6參與了胃癌的進(jìn)展過(guò)程，并與胃癌的生物行為相關(guān)，是胃癌的診斷和判斷預(yù)后的重要分子生物學(xué)檢測(cè)指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：p16；CD44v6；胃癌

胃癌預(yù)后的改善和治療效果的提高，有賴于對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制逐步深入的認(rèn)識(shí)。從蛋白質(zhì)分子水平揭示其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明，細(xì)胞癌變是由于細(xì)胞內(nèi)某些基因的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變而引起。在人類(lèi)多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)p16和CD44v6基因的異常改變和異常表達(dá).并與惡性腫瘤的臨床指標(biāo)和預(yù)后有關(guān)，p16基因是近年發(fā)現(xiàn)的新的抑癌基因。胃癌組織中pl6蛋白的表達(dá)情況，目前國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。細(xì)胞跨膜粘附分子CD44v6在人類(lèi)不同類(lèi)型腫瘤的表達(dá)，可能成為腫瘤抗體導(dǎo)向治療的基礎(chǔ)。我們采用免疫組化技術(shù)，對(duì)93例胃癌的p16和CD44v6的表達(dá)進(jìn)行研究，探討其同胃癌的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料 93例胃癌標(biāo)本為本院和外院2008年1月～2011年12月胃癌手術(shù)標(biāo)本，男60例，女33例。平均年齡56.8歲。早期胃癌l1例，進(jìn)展期胃癌82例，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性65例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性28例。Lauren分型示腸型胃癌61例，彌漫型胃癌32例。實(shí)驗(yàn)采用存檔蠟塊。另取該組胃腺癌病例中腫瘤手術(shù)切除標(biāo)本切緣處正常胃粘膜（病理證實(shí)）石蠟包埋標(biāo)本15例及癌旁粘膜15例作為對(duì)照。胃癌的TNM分期按照2010年國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（UICC/AJCC）胃癌 TNM分期 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2組織學(xué)檢測(cè)采用常規(guī)蘇木素-伊紅染色。

1.3免疫組化檢測(cè) 一抗分別為鼠抗人pl6單克隆抗體（稀釋濃度1：100）、鼠抗人CD44v6單克隆抗體（稀釋濃度1：100）及SP超敏即用型試劑盒等均由福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司提供。組織經(jīng)10 %中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4 um，連續(xù)切片分別做常規(guī)HE和免疫組織化學(xué)SP染色，免疫組織化主要操作步驟：嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陰性對(duì)照用PBS代替一抗，用已知的陽(yáng)性組織切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 pl6蛋白陽(yáng)性著色主要定位于胞漿，部分胞核呈陽(yáng)性染色，胞漿呈棕黃色或呈明顯棕黃色顆粒；CD44v6蛋白蛋白主要以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性，可同時(shí)伴或不伴有胞漿彌漫性著色。鏡下觀察10個(gè)高倍鏡視野（10×40），并根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞占視野中癌細(xì)胞總數(shù)的比例分為（-）：細(xì)胞內(nèi)無(wú)棕黃色著色，或與切片背景染色一致者；（+）：陽(yáng)性細(xì)胞<25 %；（+ +）：陽(yáng)性細(xì)胞為25 %-50% ；（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞>50 %。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0版本統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。兩樣本均數(shù)比較行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1胃癌按細(xì)胞分化程度分為高分化腺癌6例，中分化22例，低（未）分化65例。

2.2免疫組化結(jié)果 p16蛋白著色于癌細(xì)胞核及胞漿，CD44v6 著色于癌細(xì)胞膜。不同組織類(lèi)型和分化程度的胃癌其分布方式無(wú)明顯差異。93例胃癌中，p16蛋白陽(yáng)性37例（39.78%），CD44v6陽(yáng)性39例（41.94%）。與對(duì)照組比較，均有顯著性差異（P<0.05，P<0.05）。見(jiàn)表1。在胃癌的陽(yáng)性表達(dá)與患者性別、年齡、組織分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的關(guān)系見(jiàn)表2。p16蛋白在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的表達(dá)率30.8%，顯著低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的表達(dá)率60.7%（P<0.01）。CD44v6在進(jìn)展期胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組的陽(yáng)性表達(dá)率43.8%、52.3%，顯著高于早期胃癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組的陽(yáng)性表達(dá)率9.1%、17.9%（P<0.05，P<0.01）。

2.3 CD44v6與p16的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 p16、CD44v6的表達(dá)均與患者的預(yù)后有關(guān)，P16陽(yáng)性表達(dá)者生存期≥3年及5年者分別為30.8% 、18.92%，而陰性者分別為25% 、10.71% 。CD44v6陽(yáng)性表達(dá)者≥3年及5年的生存率分別為20.51%、10.26% ，而陰性者則分別是44.44% 、22.22%，見(jiàn)表3。但用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，只有P16是獨(dú)立的預(yù)后因子，見(jiàn)表4。

2.4 CD44v6與P16表達(dá)的關(guān)系 在CD44v6呈陽(yáng)性表達(dá)的37例胃癌中，P16呈陽(yáng)性表達(dá)的有9例，CD44v6呈陰性表達(dá)的54例中P16呈陽(yáng)性表達(dá)的有28例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，二者在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)系（r =-0.476，P= 0.007），說(shuō)明在胃癌組織中，CD44v6的表達(dá)隨著P16表達(dá)的減弱而增強(qiáng)，二者之間存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，見(jiàn)表5。

3 討論

細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間黏附特性的異常，是腫瘤細(xì)胞區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特征。這種黏附特性的異常賦予腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落并向鄰近正常組織浸潤(rùn)的能力，而腫瘤侵襲能力的大小是腫瘤惡性程度高低的標(biāo)志之一。CD44基因于1980年由Dalchau等采用單克隆技術(shù)檢測(cè)并確定的。CD44分子是細(xì)胞表面的黏附分子之一，根據(jù)基因外顯子表達(dá)方式的不同編碼生物學(xué)特性不同的兩種蛋白：標(biāo)準(zhǔn)型（CD44s）和變異型（CD44v）。CD44s的生理功能主要是參與細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與間質(zhì)之間的粘連；介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的歸巢及細(xì)胞的遷移。CD44v則主要出現(xiàn)在機(jī)體的病理過(guò)程，特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中[1]。CD44v的出現(xiàn)改變了腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的構(gòu)成和功能，使腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。CD44v6是CD44的一種拼接異構(gòu)體，其表達(dá)可改變腫瘤細(xì)胞表面黏附分子的構(gòu)成和功能，有助于腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能。CD44v6的促進(jìn)轉(zhuǎn)移作用機(jī)制可能是表達(dá)CD44v6的腫瘤細(xì)胞與遠(yuǎn)隔的淋巴管和血管內(nèi)某一配體結(jié)合，使轉(zhuǎn)移至那里的腫瘤細(xì)胞更加穩(wěn)定地寄宿與生長(zhǎng)，有效形成轉(zhuǎn)移瘤。近年來(lái)通過(guò)免疫組化和原位雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，CD44v6的過(guò)量表達(dá)與多種人體惡性腫瘤，如乳腺癌、胃癌、食管癌、宮頸癌等許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān) ，認(rèn)為CD44v6可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[1，2]。較多研究資料顯示：CD44v6陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤較陰性表達(dá)者惡性程度高，發(fā)展快，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)，生存期短，預(yù)后差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CD44v6在胃癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為54% ；在胃癌侵及黏膜及黏膜下層時(shí)，即胃癌的早期，就有CD44v6的陽(yáng)性表達(dá)，且其陽(yáng)性表達(dá)率隨胃癌的浸潤(rùn)深度的加深而升高，這說(shuō)明CD44v6的異常表達(dá)開(kāi)始于胃癌的早期，且貫穿于胃癌的整個(gè)浸潤(rùn)過(guò)程；其陽(yáng)性表達(dá)率與淋巴轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，提示CD44v6的陽(yáng)性表達(dá)參與了轉(zhuǎn)移過(guò)程。陽(yáng)性者3年生存率明顯低于陰性者，提示該基因的異常表達(dá)有可能成為一個(gè)較好估計(jì)預(yù)后的指標(biāo)。對(duì)于CD44v6的陽(yáng)性表達(dá)者，應(yīng)于術(shù)后嚴(yán)格進(jìn)行化療，預(yù)防胃癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。

P16基因是1994年分離鑒定的一種新型抑癌基因， 因其對(duì)多種腫瘤有抑制作用而被命名為多腫瘤抑制基因（MTSI）。P16基因定位于人染色體9p21區(qū)域，全長(zhǎng)8.5 kb，由2個(gè)內(nèi)含子及3個(gè)外顯子構(gòu)成，分子量為15.85 KD，編碼表達(dá)一個(gè)148個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（P16INK4）。p16基因產(chǎn)物作為細(xì)胞周期的負(fù)性調(diào)節(jié)成份，其功能的喪失會(huì)導(dǎo)致對(duì) 磷酸化抑制的解除，促使細(xì)胞增殖加快。研究發(fā)現(xiàn)[3-5]，P16基因及其產(chǎn)物在許多人類(lèi)原發(fā)腫瘤和細(xì)胞株發(fā)生缺失，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限制生長(zhǎng)。本文顯示，CD44v6蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織（P<0.05），而P16蛋白在胃癌組織中的陽(yáng)性率顯著低于癌旁組織（P<0.05）。范開(kāi)席等[6]研究顯示p16與胃癌組織學(xué)分化程度正相關(guān)，與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移負(fù)相關(guān)，且p16陽(yáng)性表達(dá)者的預(yù)后比陰性表達(dá)者好。他們的研究提示p16基因突變?cè)谖赴┲袕V泛存在，并參與胃癌組織分化、浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，其在胃癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的負(fù)性調(diào)節(jié)作用。陳廣斌等[7]也得出了類(lèi)似的結(jié)論，他們的結(jié)果顯示伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中p16的表達(dá)水平明顯降低，且I、II期胃癌p16陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于III、Ⅳ 期，說(shuō)明p16參與了胃癌的轉(zhuǎn)移與進(jìn)展。譚立新等[8]對(duì)p16與胃癌臨床分期的進(jìn)展也進(jìn)行了分析，他們研究表明P16的表達(dá)水平隨臨床分期的進(jìn)展、病情的加重而明顯降低，認(rèn)為P16的表達(dá)水平可作為判斷腫瘤惡性程度和估計(jì)預(yù)后重要指標(biāo)。楊蘇敏等[9]的研究則進(jìn)一步證實(shí)p16的蛋白的表達(dá)缺失不僅參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并認(rèn)為p16可作為胃癌生物學(xué)標(biāo)志之一。楊雪炎等[10]在宮頸癌中也有類(lèi)似發(fā)現(xiàn)。

本研究顯示CD44v6高表達(dá)和P16低表達(dá)與胃癌TNM分期、是否浸潤(rùn)漿膜、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝臟轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)（P<0.05），表明CD44v6和P16在胃癌的發(fā)生、臨床進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要作用。檢測(cè)CD44v6和P16蛋白表達(dá)均可作為預(yù)測(cè)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移傾向及估計(jì)預(yù)后的客觀指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，在胃癌中CD44v6表達(dá)與P16表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示p16和CD44v6在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中沿著各自的方向起不同的作用，同時(shí)存在某種負(fù)性調(diào)節(jié)作用。深入探討它們之間相互作用的機(jī)制，將對(duì)闡明腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制及阻斷其轉(zhuǎn)移途徑具有重要價(jià)值。

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