乙型肝炎病毒DNA定量檢測室內質控品的制備及應用研究

摘要：目的 自制乙型肝炎病毒DNA室內質控血清并探討其在臨床標本檢驗中的應用價值。方法 用檢測后的患者標本自制陽性室內質控血清，用實時熒光定量PCR檢測血清HBV-DNA，記錄2013年1～5月質控結果、標準曲線的斜率、截距、相關系數和相關結果的均值（x）、標準差（s）及變異系數（cv）；結果 自制質控物結果對數的累計數據 x±2s范圍為4.3～5.34，在該質控的參考值范圍內；結論 本實驗室采用Taqman實時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA實驗中，質控品穩定性良好，可聯合運用多參數同時監測的質控方法進行，能保證為臨床提供有效可靠的準確結果。

關鍵詞：聚合酶鏈式反應；室內質控；斜率；截距；相關系數

乙型肝炎屬于我國高發的流行性疾病。日前為止，我國慢性乙型肝炎病毒感染者約為1.3億，其中慢性乙型肝炎患者約5000萬例。HBV DNA定量檢測可反映病毒復制水平，主要用于慢性HBV感染的診斷、治療適應證的選擇及抗病毒療效的判斷[1]。一般當患者肝功波動，轉氨酶升高，乙肝病毒復制指標陽性，肝功處于代償階段的時候，抗病毒治療最為合適[2]。實時熒光定量PCR是目前核酸定量檢測較為理想和方便的方法之一，而Taqman探針技術的應用更大大增加了探針的雜交穩定性，使結果更精確、分辨率更高[3]。但其結果因反應體系、系統誤差、檢測條件、人員等多種因素影響，易致結果的批內、批間差異較大，因此需要好的質控方法和質控品保證結果的穩定性和可靠性。我室收集2013年1～5月對自制HBV-DNA陽性質控血清檢測的質控結果、標準曲線和相關結果的均值（x）、標準差（s）及變異系數（cv）進行累積數據評價，斜率、截距、相關系數結果分析如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 儀器為廣州中山大學達安基因股份有限公司生產的DA7600熒光定量擴增分析儀，試劑為該公司配套試劑。

1.2 質控血清來源 選取日常患者無溶血、無脂血、無黃疸的陽性血清標本（乙肝病毒定量值104～105），收集標本血清20ml，混勻，進行HBV-DNA定量檢測，結果為6.93×104，對數值為4.84，在預期范圍內。然后將血清分裝至0.5ml離心管中，每管0.1ml，保存于-20℃以下的冰箱，做為陽性質控品。取其中20份進行分次檢測，確定該質控品結果對數靶值為4.99，標準差為0.22，變異系數為5.5%， x±s范圍為4.5～5.38。

1.3 試驗方法 按試劑盒說明書進行DNA模板提取，加入2μl至PCR反應管中，與患者標本及試劑盒自帶標準曲線同時擴增。循環參數設置為：93℃，2min；93℃，45s；55℃，60s；10個循環；93℃，30s；55℃，45s；30個循環。從第11循環開始檢測熒光信號。擴增完成后進行數據自動分析，得到該次擴增的質控結果及標準曲線的斜率、截距、相關系數。

1.4 分析方法 將陽性質控結果轉換為對數形式記錄，結合Levey-Jennings質控圖和Westgard質控規則進行分析與判斷。使用EXCEL完成數據的統計與分析，對不同批號的檢測試劑質控結果和標準曲線三項參數的均值、標準差及變異系數兩兩比較采用SPSS11.5進行 χ2檢驗。

2 結果

2.1 2013年1～5月的檢測結果累積數據分析（見表1）

質控結果對數數值結果Levey-Jennings質控圖（見圖1），結果顯示未有失控點。

2.2 不同批號質控結果對比 不同批號檢測試劑的質控結果的對數，標準曲線的斜率、截距和相關系數各對應結果的均值、標準差、變異系數的 χ2檢驗結果P>0.05，顯示無統計學意義。

3 討論

乙肝熒光定量PCR技術是在PCR系統中加入帶有乙肝病毒DNA特殊位點的熒光標記探針，以此來檢測患者體內乙肝病毒DNA含量，具有高準確性、高靈敏度、高特異性的特點。現已在各醫院得到廣泛應用，對疾病診斷、治療發揮著重要作用。目前多采用外標法的TaqMan實時熒光定量PCR，受模板濃度、PCR反應體系的批內、批間差異等影響較大[4]。為保證檢測結果的準確性仍需進行室內質控活動。室內質控是由實驗室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續評價本實驗室工作的可靠性程度，對影響檢驗報告質量的技術、管理、人員、儀器等因素予以有效的監測和控制，保證實驗室工作的精密度，提高本室常規工作中批內、批間樣本檢驗的一致性，以確保臨床基因擴增檢驗報告質量符合要求、質量體系有效運行，確定測定結果是否可靠，可否發出報告。

在本研究中，我室通過質控品對熒光定量PCR檢測標本的批內、批間一致性進行監測，通過標準曲線對該次實驗的結果可行性進行判斷。標準曲線中的斜率反映了實驗的靈敏度，截距指示實驗中的空白值，相關系數代表了實驗的精密度。斜率和截距的動態趨勢圖可部分顯示實驗的動態變化，相對質控品的變異波動小，均可反映實驗情況和試劑動態變化；相關系數反映X軸和Y軸的相關性，可用以評價擴增是否有效，實驗結果是否可用。通過對這三項系數的比較，能從另一方面衡量質控結果的穩定性。

我室采用的自制質控血清，經同行驗證，具有質量穩定，精密度可靠的特點，無需特殊處理便可滿足PCR實驗室HBV DNA檢測室內質量控制的需要[5]。由質控圖中可以看出，整個分析時間段均無質控結果超過3s，偶見有超過警告下限2s。分析原因，可能包括實驗人員的操作差異，試劑批號差異，提取方法，質控品保存溫度及系統偶然誤差等因素導致DNA模板丟失、擴增效率降低、重復性低。我室采用實驗人員的操作培訓，進一步規范實驗室管理等措施后，質控值回到靶值附近。通過分析標準曲線的三項參數，可看出實驗的結果具有可行性及穩定性，且質控對數值的波動與標準曲線的斜率及截距的波動變化趨勢基本一致，說明了標準曲線對質控值的影響，從而可以建立同時對質控對數值和標準曲線的斜率及截距進行同時監測的質控系統，增加整個室內質控系統的穩定性。

參考文獻：

[1]中華醫學會肝病學分會. 慢性乙型肝炎防治指南[J]. 中國臨床醫生， 2012， 40（4）： 66-78.

[2]劉士敬， 孫永強. 乙肝抗病毒治療存在的問題及其對策[J]. 醫學與哲學（臨床決策論壇版）， 2006， 8（27）： 28-30.

[3]歐陽松應， 楊冬. 實時熒光定量PCR技術及其應用[J]. 生命的化學， 2004， 24（1）：74-76.

[4]黃學忠. 熒光定量PCR室內質控體系的概念及方法[J]. 國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊， 2005， 26（7）： 478.

[5]劉兆軍. 熒光定量PCR檢測HBV DNA室內質控的建立與應用評價[J]. 醫藥前沿， 2013（4）： 32-33.編輯/成森