歸脾湯對產后抑郁模型大鼠行為學影響的研究

崔艷超，唐啟盛，趙瑞珍，楊歆科

產后抑郁（postpartum depression，PPD）是產褥期精神綜合征中最常見的一種抑郁癥狀。通常在產后6周內出現癥狀，可持續至整個產褥期或更長時間［1］，表現為易激惹、恐怖、沮喪以及對自身和嬰兒健康過度擔心。產婦常失去生活自理和照顧嬰兒能力，甚至做出傷害嬰兒的行為或自殺［2］。國外使用愛登堡產后抑郁量表（EDPS）所調查的產后抑郁發生率為3.5%～33%［3］。國內報道各地區發病率存在差異，張小松等［4］研究產后6 個月產后抑郁患病率為5.7%，上海市發病率為8.0%～10.7%［5］，南京市為23.25%［6］，但多數報道認為產后抑郁目前的發病率呈升高趨勢。目前西醫在產后抑郁癥的治療方面存在藥物通過母乳被嬰兒吸收的危險，患者的接受度較差，而傳統中醫藥在本病的治療方面有療效顯著，毒副反應小、依賴性少等優勢。歸脾湯是中醫臨床治療產后抑郁癥常用的方劑之一。本研究通過構建產后抑郁模型大鼠，研究歸脾湯對大鼠行為學的影響，旨在初步探討歸脾湯對治療產后抑郁癥模型大鼠的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雌性SD 大鼠，SPF級，體重200g±20g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2006－2009。適應性喂養一周，光照節律12L／12D（06：00～18：00光照），室溫（18±2）℃，相對濕度60%～70%，實驗過程中保持安靜，不限食水（術前禁食，蔗糖水實驗前禁水）。

1.2 藥品與試劑 歸脾湯（組成為黃芪15g，黨參10 g，白術、茯苓、龍眼肉、酸棗仁、當歸、遠志各12g，枳殼9g，龍骨、生牡蠣各30g，甘草6g），由北京中醫藥大學第三附屬醫院購置，按照灌胃劑量煎藥濃縮，生藥濃度1.72g／mL，貯存于4 ℃冰箱中備用，用前加熱。鹽酸氟西汀膠囊Patheon France公司生產，禮來蘇州制藥公司分包裝，批號0943A，按照成人用量7倍計算大鼠用量為2.33mg／（kg·d）［7］。臨用時溶于蒸餾水，混勻，濃度為0.233g／L。造模用激素：苯甲酸雌二醇注射液（天津金耀氨基酸有限公司，批號1007251）；黃體酮注射液（上海通用藥業股份有限公司，批號110502）。高效液相色譜試劑：5－HT（美國Sigma公司，批號028K5152），內標物羥苯甲酸（美國Sigma公司，批號04429MO）免疫組織化學試劑：兔抗5－HT1AR 抗體（北京博奧森生物技術有限公司，批號990682W）；即用型免疫組化試劑盒（兔）（福州邁新生物技術開發有限公司，批號1112019706）；二氨基聯苯胺顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，批號11111030031）。

1.3 造模及動物分組

1.3.1 動物分組與處理 購入大鼠先適應性喂養1周（此期間常規喂養，保持環境安靜，每日照明時間為7：00～19：00，形成晝夜規律），1周后所有動物進行敞箱測試（open－field test，OFT），根據評分結果篩選合格動物并隨機分組，分為正常組、假手術組、模型組、歸脾湯組、氟西汀組，共5組，每組均設處理后1周、4周兩個不同觀察時點。各組每個時點動物均為6只。

1.3.2 模型建立

1.3.2.1 去勢手術操作 參照Galea等［8］報道方法制作，具體如下：10%水合氯醛（0.4mL／100g）腹腔注射麻醉，左側位固定于手術臺，選取脊柱旁開一橫指、肋緣后一橫指皮膚，局部備皮、消毒。自腰椎沿背部正中線向下做縱行切口約1cm，切開皮膚，用圓頭剪插入皮膚與肌肉之間，鈍性剝離。擴張肌肉層，暴露內部組織，定位右側子宮角，用鑷子輕輕夾住周圍脂肪組織將其拉出體外，沿子宮角向上找到輸卵管及卵巢，結扎后摘除，將子宮體送回腹腔。觀察切口無出血，于創口局部涂灑青霉素預防感染，后分別縫合肌肉、皮下脂肪層及表皮。同法行對側卵巢摘除，術后將大鼠單獨置于籠中恢復。假手術組手術操作步驟同上，但不切除雙側卵巢，僅摘取卵巢周圍少許脂肪組織。

1.3.2.2 陰道涂片篩查 于卵巢切除手術完成后第2天進行陰道涂片檢查，將用生理鹽水浸濕的棉簽插入動物陰道內，輕輕轉動幾下后取出，將粘有陰道脫落細胞的棉簽在玻片上均勻涂抹。待玻片干燥后，在涂抹處滴加兩滴美蘭，固定15min，用純水沖掉美蘭。每日1次，連續5d，鏡下觀察大鼠5d內陰道分泌物的細胞學變化，判斷大鼠是否存在動情周期的改變。有變化者表示卵巢未切除干凈，激素水平正在恢復，剔除不用。

1.3.2.3 雌、孕激素注射 選取去勢手術合格動物，前16d每日皮下注射雌二醇注射液0.1mL（2.5μg）、黃體酮注射液0.2mL（4mg），后7d每日注射雌二醇注射液0.1mL（50μg），以模擬大鼠“妊娠”狀態下的激素分泌水平，第24天（即“產后”第2天）停止激素注射。正常組、假手術組動物前16d每日皮下注射芝麻油0.3mL，后7d每日注射芝麻油0.1mL。

1.3.3 藥物干預 造模結束后進行藥物干預，藥物灌胃體積均為1mL／100g體重。中藥組、西藥組分別予歸脾湯、鹽酸氟西汀，正常組、假手術組、模型組給予等容量雙蒸水。灌胃劑量根據動物每周體重變化進行調整，各組灌胃干預按要求分別于造模后1周、4周不同時點結束，進行相關行為學測試后處死取材。

1.4 行為學觀察

1.4.1 糖水消耗測試 測試前禁水24h，后各組動物自由飲用1%的蔗糖水1h，計算每只動物的蔗糖水消耗量。蔗糖水飲用量＝測定前瓶重（g）－測定后瓶重（g）。糖水消耗試驗體現大鼠對獎賞的快感反應。

1.4.2 曠場實驗 自制OPEN－FIELD 敞箱，高40 cm，長和寬均80cm。四周箱壁為黑色，底面用黑線均勻劃分為相等面積的25塊方格。以動物穿越方格數作為水平活動的得分（以動物四爪均進入方格為準），以直立次數為垂直活動得分（兩前肢離地為一次作為標準）。每只動物僅測定一次，每次3min。室內隔音，每次測試前保持敞箱內干凈。曠場試驗的水平活動反映了大鼠的運動活動性水平，垂直活動的多少則反映其興趣高低。

1.4.3 強迫游泳測試 也稱行為絕望實驗或Porsolt實驗。將大鼠置于水深（15～18）cm 的圓柱形透明容器（泳池）中，進行15min“前游泳”。然后將大鼠從泳池中取出、烘干，進行干預（藥物或者治療），干預后放回籠中飼養。“前游泳”應激24h后，將大鼠再次置于泳池中，進行5min“測試游泳”并錄像。觀測并記錄游泳時間（大鼠在泳池內水平面上、泳池內四周游動的時間）、掙扎時間（包括動物俯沖、前肢拍打水面以及抓爬玻璃瓶壁的時間）、不動時間（累計動物在水中停止掙扎呈直立漂浮狀態，或僅有偶爾的肢體運動以保持頭部浮在水面的持續時間）。分析干預措施對大鼠行為的影響，推測其抗抑郁活性。

2 結 果

2.1 大鼠體重的變化 組間比較，除歸脾湯組4周及氟西汀組4周外，模型組、歸脾湯組和氟西汀組其余各時間點體重均較正常組升高（P＜0.05，P＜0.01）；歸脾湯組1周、4周及氟西汀組各時點均較模型組升高（P＜0.05，P＜0.01）；歸脾湯組和氟西汀組于各個時點比較均無統計學意義（P＞0.05）。組內比較，模型組、歸脾湯組和氟西汀組體重均呈增加趨勢，但模型組較歸脾湯組、氟西汀組增長幅度明顯緩慢，歸脾湯組經藥物干預后可達正常水平。模型組、歸脾湯組和氟西汀組4周時較各自1周時體重水平顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表1。

表1 不同處理大鼠體重差異比較 g

表1 不同處理大鼠體重差異比較 g

與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01；與本組1周時比較，5）P＜0.05，6）P＜0.01。

組別 n 1周 4周正常組6 281.17±12.45 315.08±20.03假手術組 6 279.17±14.30 313.46±17.31模型組 6 262.33±12.712） 278.75±17.662）5）氟西汀組 6 270.92±13.902）3） 302.29±16.631）3）6）歸脾湯組 6 268.54±11.982）3） 305.29±17.894）6）

2.2 大鼠蔗糖水消耗量比較 組間比較，模型組、歸脾湯組各個時點與氟西汀組1周時，蔗糖水消耗量較正常組、假手術組降低（P＜0.05，P＜0.01）；氟西汀組及歸脾湯組4周時，較模型組均升高（P＜0.01）；歸脾湯組4周時，較氟西汀組降低（P＜0.05）。組內比較，模型組蔗糖水消耗量呈逐漸下降趨勢，而歸脾湯組和氟西汀組趨勢則相反。模型組4周時較其1周時消耗量顯著降低；歸脾湯組和氟西汀組4 周時，蔗糖水消耗水平均較其1周時消耗水平有所增加（P＜0.01，P＜0.05）。詳見表2。

表2 不同處理大鼠蔗糖水消耗量比較g

表2 不同處理大鼠蔗糖水消耗量比較g

與正常組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.01；與氟西汀組比較，4）P＜0.05；與本組1周時比較，5）P＜0.05，5）P＜0.01。

組別 n 1周 4周正常組6 16.08±7.91 17.04±3.47假手術組 6 16.79±4.87 18.67±3.54模型組 6 10.42±4.181） 6.33±2.932）5）氟西汀組 6 10.04±5.141） 16.63±3.833）5）歸脾湯組 6 9.25±3.852） 14.38±3.891）3）4）6）

2.3 大鼠曠場實驗得分比較

2.3.1 水平得分 組間比較，模型組、歸脾湯組、氟西汀組各時點Open－Field水平得分均較正常組、假手術組降低（P＜0.05或P＜0.01）；歸脾湯組、氟西汀組除1周外，其余各時間點均較模型組水平得分顯著升高（P＜0.01），歸脾湯組和氟西汀組之間各時點比較無統計學意義（P＞0.05）。組內比較，模型組、歸脾湯組、氟西汀組Open－Field水平得分均呈升高趨勢，且歸脾湯組、氟西汀組升高幅度較模型組明顯。模型組、歸脾湯組和氟西汀組4周時，曠場實驗水平得分均較其1周時顯著升高（P＜0.01）。詳見表3。

表3 不同處理大鼠曠場實驗得分 分

表3 不同處理大鼠曠場實驗得分 分

與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與本組1周比較，3）P＜0.05。

組別 n 1周 4周正常組6 75.17±15.58 81.54±14.66假手術組 6 81.42±20.03 77.13±15.20模型組 6 32.04±10.001） 40.29±8.311）3）氟西汀組 6 27.79±10.251） 55.63±12.821）2）3）歸脾湯組 6 29.88±5.291） 60.25±8.131）2）3）

2.3.2 垂直得分 組間比較，模型組、歸脾湯組、氟西汀組各時間點Open－Field垂直得分均較正常組、假手術組降低（P＜0.05或P＜0.01）；歸脾湯組1周時及歸脾湯組、氟西汀組4周時，均較模型組垂直得分升高（P＜0.05或P＜0.01）；歸脾湯組、氟西汀組于各時點相比差異無統計學意義（P＞0.05）。組內比較，氟西汀組Open－Field 垂直得分均呈逐漸升高趨勢，模型組、歸脾湯組呈降低后又逐漸升高趨勢。模型組、氟西汀組4周時較其1周時顯著升高（P＜0.05）。詳見表4。

表4 不同處理大鼠曠場實驗垂直得分 分

表4 不同處理大鼠曠場實驗垂直得分 分

與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與本組1周時比較，4）P＜0.05。

組別 n 1周 4周正常組6 17.79±4.63 20.67±5.62假手術組 6 18.88±4.38 21.42±5.02模型組 6 8.42±3.011） 10.58±3.671）4）氟西汀組 6 10.42±2.901） 14.46±3.811）3）4）歸脾湯組 6 12.79±3.981）3） 13.54±4.171）2）

2.4 大鼠強迫游泳時間比較

2.4.1 不動時間 組間比較，模型組、歸脾湯組、氟西汀組各時間點強迫游泳不動時間均較正常組、假手術組顯著增高（P＜0.01）；歸脾湯組、氟西汀組各時間點強迫游泳不動時間均較模型組顯著降低（P＜0.05），歸脾湯組與氟西汀組比較無統計學意義（P＞0.05）。組內比較，模型組強迫游泳不動時間呈明顯增加后又逐漸減少趨勢，歸脾湯組、氟西汀組呈逐漸減少趨勢。歸脾湯組、氟西汀組4周時均較其1周時顯著減少（P＜0.01）。詳見表5。

表5 不同處理大鼠強迫游泳實驗不動時間 s

表5 不同處理大鼠強迫游泳實驗不動時間 s

與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05，3）P＜0.01；與本組1周時比較，4）P＜0.01。

組別 n 1周 4周正常組6 63.71±13.94 68.17±18.87假手術組 6 71.46±13.45 74.38±17.98模型組 6 148.29±27.321） 152.88±20.101）氟歸西脾汀湯組組 66 112140..9265±±2109..066911））23））9845..4466±±2212..820911））33））44））

2.4.2 掙扎時間 組間比較，模型組、歸脾湯組、氟西汀組各時間點掙扎時間均較正常組、假手術組顯著減少（P＜0.01）；歸脾湯組、氟西汀組各時間點均較模型組顯著增加（P＜0.01）；氟西汀組1周時較歸脾湯組顯著減少（P＜0.05）。組內比較，模型組FST 掙扎時間呈稍減少后逐漸增加，此后又迅速減少趨勢，歸脾湯組、氟西汀組則表現為逐漸增加后又降低。歸脾湯組、氟西汀組4周時掙扎時間均較其1周時顯著增加（P＜0.05）。詳見表6。

表6 不同處理大鼠強迫游泳實驗掙扎時間 s

表6 不同處理大鼠強迫游泳實驗掙扎時間 s

與正常組比較1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與氟西汀組比較，3）P＜0.05；與本組1周時比較，4）P＜0.05。

組別 n 1周 4周正常組6 137.21±19.25 142.08±20.66假手術組 6 131.58±17.98 130.17±18.81模氟歸型西脾組汀湯 組組 666 879793.. .339863±± ±111755...237295111）））22 ））3 ）11 811009...257909±±±121909...774787 111）））22））44））

2.4.3 游泳時間 組間比較，模型組4周時游泳時間較正常組、假手術組顯著減少（P＜0.01）；歸脾湯組、氟西汀組4周時，較模型組游泳時間顯著延長（P＜0.05或P＜0.01）。組內比較，模型組FST 游泳時間呈降低又逐漸升高趨勢，歸脾湯組逐漸升高，但二者各時間點間均無統計意義（P＞0.05），氟西汀組隨時間推移升高趨勢較明顯。詳見表7。

表7 不同處理大鼠強迫游泳實驗游泳時間 s

表7 不同處理大鼠強迫游泳實驗游泳時間 s

與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別 n 1周 4周正常組6 99.08±24.03 89.75±28.81假手術組 6 96.96±20.12 95.46±25.60模型組 6 78.38±29.79 66.83±27.931）氟西汀組 6 87.67±29.52 95.04±31.132）歸脾湯組 6 89.79±26.58 94.75±31.022）

3 討 論

3.1 產后抑郁動物模型的評判 實驗動物的抑郁征象往往可通過其表征及行為學的變化予以反映。有關產后抑郁癥模型動物抑郁表現的評測，主要沿用抑郁癥實驗動物研究中的相關方法，包括一般表征的觀察以及目前較為公認的諸如蔗糖水消耗、曠場實驗、強迫游泳實驗等行為學評測［9－12］。本實驗中的動物一般表征顯示，正常大鼠皮毛光澤度好，毛發梳理動作及自由活動較多，且對周圍環境顯現出極大的興趣而時常進行探究，同時體重增長速度較快。模型大鼠經激素刺激妊娠后，激素突然停撤，于造模后1周時，即呈現毛發光澤暗淡、活動度下降、疲乏倦怠等狀態，體重增長亦緩慢，其上述表征至4周時雖稍有改善，但較正常大鼠仍有明顯差異。相關行為學結果表明，正常大鼠對蔗糖水飲用快感明顯，消耗量較大；曠場實驗水平及垂直活動均有較高評分；強迫游泳實驗不動時間較短，主要表現為掙扎與游泳行為。模型動物蔗糖水消耗量則隨時間推移而呈現逐漸減少趨勢；曠場實驗中水平及垂直活動評分明顯下降；強迫游泳實驗不動時間顯著延長。而在經歸脾湯或鹽酸氟西汀干預后，模型大鼠在一般狀況與行為學方面均有明顯變化，至4周時已有顯著改善。以上模型動物出現的各種表征及行為學方面的改變，顯現出大鼠于造模后的明顯抑郁狀態，此充分證實激素刺激妊娠后的激素突然停撤模型制備方法的成功性，同時也顯示出藥物干預的有效性。

3.2 中醫辨證論治產后抑郁癥 產后抑郁癥是指產婦產后出現的以落淚、悲傷、情緒不穩、罪惡感、厭食、睡眠障礙、注意力不集中和記憶困難、疲乏、易激惹等為特征的一種神經癥狀性抑郁。傳統中醫藥并未有“產后抑郁”這一明確的病名，但多有產后情志異常的記載，并將其歸入“郁證”的范疇。隨著朝代的遷延，中醫對產后抑郁癥的認識和了解也有所不同，但綜觀古代醫家對產后抑郁癥的論治原則，皆以補虛、祛瘀為要旨，并逐步從單純的補虛發展為補虛與祛瘀并重。現代中醫對產后抑郁癥辨證進一步研究和細化，認為該病與心、肝、脾、腎四臟相關，主要成因為產后氣血虧虛，敗血滯留成瘀，瘀血停積，敗血攻心等，可分為血虛氣弱證、敗血停積證、心脾兩虛證等不同證型，治療措施也不盡相同。血虛氣弱證可選用茯神散；敗血停積證可選用調經散或芎歸瀉心湯，另包五靈脂沖服；心脾兩虛證可選用歸脾湯或養心湯［13，14］。本研究選用歸脾湯考察其產后抑郁模型大鼠行為學的改善，結果證實歸脾湯對大鼠體重、糖水消耗量、曠場實驗和強迫游泳實驗結果均有一定程度的改善和提高，說明歸脾湯對治療產后抑郁癥臨床表征有一定的改善作用，這與范彥蓉等［15］的臨床研究報道結果相一致。歸脾湯在治療產后抑郁癥方面的應用有待進一步推廣和加強。

歸脾湯在多個指標的改善方面，如體重、蔗糖水消耗、曠場實驗垂直評分等，總體改善趨勢較氟西汀明顯，而隨著藥物干預的不斷持續，4周時可顯現出較氟西汀相對好的效果。由此表明，歸脾湯對于產后抑郁癥的持續改善作用優勢利于長期服用，在疾病治療早期可采取中西醫結合的方式，以歸脾湯與氟西汀聯合給藥效果更佳，但具體療效還有待進一步研究。

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