RNA 干擾Bax對急性心肌梗死大鼠心肌細胞的保護作用

張永勝

急性心肌梗死是臨床常見的心腦血管疾病之一，其發病率、致死率和致殘率高，已經成為嚴重影響人類健康的公共疾病之一［1，2］。目前研究顯示心肌梗死產生的氧化應激、負荷過重、缺血、缺氧、再灌損傷等可誘導心肌細胞凋亡，因此如何有效地抑制心肌細胞凋亡，對緩解和治療急性心肌梗死具有重要的意義［3］。Bax是Bcl－2家族中研究最為廣泛的促凋亡蛋白，其主要表達于細胞質中，可形成同源二聚體或者與Bcl－2 形成異源二聚體而介導細胞凋亡［4，5］。近年來研究顯示在急性梗死心肌組織中Bax 蛋白的表達量明顯升高，提示其可能參與了急性心肌梗死心肌細胞的凋亡，加重了心肌功能的損傷［6］。RNA 干擾技術是近年來發展起來的基因操作技術，其可特異性的沉默相關基因的表達，對調節細胞生物學功能具有重要的意義［7］。本研究探討了RNA 干擾技術沉默Bax 基因對急性心肌梗死大鼠心肌組織的保護作用，旨在為臨床治療急性心肌梗死提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SD 大鼠（180g～200g）購自上海萊斯克動物有限公司；Bax一抗購自美國Abcam 公司；HRP－羊抗鼠二抗購自santa cruz公司；脂質體和Triozol購自Invitrogen公司；SYBR Green通用型qPCR Master Mix 購 自 羅 氏 生 物；Real－time PCR 擴 增 儀 購自Applied Biosystems；逆轉率試劑盒購自TAKARA公司；經修飾的Bax－siRNA 由吉瑪生物合成；；TUNNEL試劑盒購自羅氏生物；TTC 染液購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.2 急性心肌梗死大鼠模型構建及治療 45只大鼠隨機分為假手術組、心梗組和Bax干擾組。所有大鼠采用10%的水合氯醛麻醉，固定大鼠并打開胸腔，假手術組不做左冠狀動脈前降支結扎。心梗組和Bax干擾組大鼠開胸后行左冠狀動脈前降支結扎術。模型構建成功標志為：大鼠左心室前壁蒼白，多導生理記錄儀顯示大鼠心電標準Ⅱ導聯，ST 段抬高和（或）T 波抬高。手術結束后所有大鼠關閉胸腔，手術切口注射青霉素抗感染。假手術組和心梗組在術前12h心肌組織內注射100μL脂質體，Bax干擾組大鼠術前心肌注射脂質體與Bax siRNA 的混合物100μL。術后72h處死大鼠，取心肌組織進行指標分析。

1.3 大鼠心肌組織Bax mRNA 表達水平變化 大鼠心肌組織0.1g 加入1 mL riozol中勻漿，然后加入2 0 0μL三氯甲烷振蕩混勻，冰上靜置分層，1 2 0 0 0 r／min離心15min，上清加入等體積的異丙醇中，冰上放置30min使RNA 沉淀，然后12 000r／min離心15 min，棄上清，沉淀部分用預冷的75%乙醇溶液洗滌2次，8 000r／min離心10min，沉淀用DEPC 水處理的雙蒸水溶液中。分光光度儀測量RNA 濃度采用TAKARA 逆轉錄試劑轉錄成cDNA。

設計大鼠Bax的PCR 引物，引物序列如下：Bax－F：5′－GGCGATGAACTGGACAAC－3′；Bax－R：5′－CCGAAGTAGGAAAGGAGGC－3′。引物由上海英俊生物公司合成。對引物特異性和退火溫度進行優化。然后按照下述反應體系制備反應混合物：2×SYBR Green通用型qPCR Master Mix 10μL，上游／下游引物各（10μmmol／L）各1μL，cDNA 1μL，補雙蒸水至終體積為20μL。根據檢測樣本的數量配制相應的體積，對應加入PCR 板中，每孔20μL。1 500r／min離心將反應混合物甩至管底，根據下列反應條件進行PCR：預變性：95 ℃，30s；變性：95 ℃，3s；退火延伸：60 ℃，30s；構建溶解曲線。最后從實時熒光定量PCR 儀上直接讀取數據。

1.4 大鼠心肌組織Bax蛋白質表達水平變化 大鼠心肌組織取出后用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，經抗原修復后，切片用3%過氧化氫－甲醇液室溫處理20 min，清除內源性的過氧化氫酶，PBST 洗滌3次，每次5min。用10%山羊血清37℃封閉30min，然后滴加一抗工作液4 ℃孵育過夜；次日37 ℃回溫30min后用PBST 洗滌3次，每次5min；在切片上滴加二抗工作液37℃孵育30 min，然后PBST 洗滌3 次，每次5 min；DAB 顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精返藍。然后梯度脫水，中性膠封片。評定方法：每張切片隨機選取10個視野，放大400 倍，采用Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統對免疫組化進行半定量分析。

1.5 大鼠心肌組織梗死范圍分析 大鼠心肌組織切成厚度2mm 的薄片，置于1%的TTC 磷酸緩沖液中37 ℃染色20min。理論上正常組織應該為紅色，梗死組織為白色。然后再顯微鏡下將梗死組織與正常心肌組織分開，用分析天平稱取正常組織和梗死組織的濕重，梗死范圍為梗死組織重量占左心室總質量的百分數。

1.6 大鼠心肌細胞凋亡指數 心肌組織切片經抗原修復脫蠟后，PBST 洗滌3次，每次5min。此后步驟嚴格按照TUNEL試劑盒操作說明進行操作。觀察時標本放大400倍，隨機選取梗死區和周邊區域10個視野，計算凋亡細胞占總細胞的比例作為心肌細胞的凋亡指數。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0統計學軟件分析，計量資料以均數±標準差表示，多組計量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠心肌組織Bax mRNA 和蛋白質水平變化（見圖1） 與假手術組比較，心梗組和Bax干擾組大鼠心肌組織中Bax mRNA和蛋白質水平明顯升高（P＜0.05）。Bax干擾組大鼠心肌組織中Bax mRNA和蛋白質水平較心梗組明顯下降（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織中Bax mRNA 和蛋白質水平

2.2 大鼠心肌組織梗死范圍比較（見圖2） 采用TTC染色法分析了大鼠心肌梗死模型不同處理后大鼠心肌組織梗死范圍變化，心梗組和Bax干擾組大鼠心肌組織梗死范圍較假手術組明顯增加（P＜0.05）。而Bax干擾組大鼠心肌組織梗死范圍較心梗組明顯下降（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠心肌組織梗死范圍比較

2.3 大鼠心肌細胞凋亡指數比較 大鼠心肌細胞的凋亡主要存在于梗死邊緣，而遠離梗死區細胞凋亡水平較低。假手術組大鼠心肌凋亡指數僅為（3.54±1.02）%，而心梗組和Bax干擾組大鼠心肌細胞的凋亡指數分別為（51.32±7.02）%和（20.45±6.77）%。心梗組和Bax干擾組心肌細胞凋亡指數明顯高于假手術組（P＜0.05）。Bax干擾組大鼠心肌細胞凋亡指數明顯低于心梗阻（P＜0.05）。

3 討 論

急性心肌梗死發生后除了心肌壞死外，心肌細胞凋亡也是急性心肌梗死后心肌發生的另一重要的生物學過程，急性心肌梗死后心肌細胞凋亡主要位于缺血壞死邊緣，而遠離梗死區心肌細胞凋亡較少［8］。這一結果與本研究相一致。心肌細胞凋亡可導致心肌細胞的大量丟失，進一步增加心肌損傷，促進了疾病的發展。因此有效的降低心肌細胞凋亡對降低急性心肌梗死患者疾病進展，爭取更多的治療時間有著重要的意義。細胞凋亡是一個高度調控的過程，此過程受到諸多的細胞因子和調節蛋白的參與，其中Bax蛋白是細胞凋亡途徑中重要的分子。Bax蛋白是Bcl－2家族成員之一，其與Bcl－2 的比例直接決定著細胞的命運。近年來，臨床研究顯示在急性心肌梗死后數小時內，心肌組織中的Bcl－2表達量會有一定程度的增加，其可抑制心肌細胞的凋亡，起到保護心臟的作用，但是這種高表達只能短暫的，在疾病進展數小時后，心肌細胞中Bcl－2蛋白很快消失，繼而出現Bax 蛋白的高表達，Bax蛋白高表達使細胞命運趨于凋亡，其可通過與Bcl－2形成異源二聚體或者自身形成同源二聚體，介導細胞的凋亡，在急性心肌梗死組織中則而表現出心肌細胞大范圍凋亡［9，10］。因此有效的預防急性心肌梗死患者心肌組織中Bax蛋白的高水平表達可能對急性心肌梗死患者心肌組織具有一定的保護作用。RNA 干擾技術是利用雙鏈RNA 高效、特異性降解細胞內同源信使RNA，從而阻斷特定基因表達，使細胞出現靶基因缺失的表型方法［11，12］。

本研究采用RNA 干擾技術沉默了急性心肌梗死大鼠心肌組織中的Bax，分析其在急性心肌梗死大鼠心肌保護中的作用。

本研究設計的并經特殊修飾的Bax siRNA 可在體內起到抑制Bax表達的作用，結果顯示，在經Bax siRNA 處理后大鼠心肌組織中Bax mRNA 和蛋白質水平較心梗組明顯下降。實驗進一步分析了Bax沉默對急性心肌梗死大鼠心肌梗死范圍的影響，顯示經Bax siRNA 處理的大鼠心肌梗死范圍較心梗組大鼠明顯下降，但是仍然高于假手術組，提示Bax沉默可降低急性心肌梗死大鼠心肌梗死范圍，起到保護心肌功能的作用。在心肌細胞凋亡方面，Bax siRNA 明顯降低了急性心肌梗死大鼠心肌細胞的凋亡，與心梗組比較具有統計學意義。Bax基因沉默可顯著降低急性心肌梗死大鼠心肌組織的梗死范圍，同時降低心肌細胞的凋亡指數，對心臟功能具有一定的保護作用。

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