shR-377聯合細胞因子誘導人脂肪間充質干細胞向神經干細胞定向分化

張淑華 劉秋玲 吳志婷 王云霞 溫明華 葛郁芝

(江西省人民醫院 江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

近年來發現，隨著心肌缺血、損傷、壞死和重構，同一區域的心臟自主神經，尤其是交感神經也隨之發生一定程度的損傷、壞死和重構〔1〕。對于心臟自主神經的損傷壞死，目前還沒有找到有效的解決辦法。近年，利用RNAi研究干細胞的增殖與分化已有一些報道。Zeng等〔2〕使用miR-100靶向BMPR2調節脂肪間充質干細胞(ADMSCs)成骨分化。Yang等〔3〕發現miR-138能夠抑制 ADMSCs的脂肪分化。Uchida等〔4〕報道miR-9調控神經祖細胞的增殖與遷移。Doddapaneni等〔5〕過表達miR-122提高胎肝干細胞的肝細胞分化。為了探索人ADM-SCs(HADMSCs)向神經干細胞(NSCs)分化的高效率誘導方法，又鑒于本實驗室有shR-377誘導骨髓間充質干細胞向造血干細胞誘定分化的研究基礎，本文選擇了shR-377聯合細胞因子誘導HADMSCs向NSCs定向分化，以期提高HADMSCs向NSCs誘導分化的轉化率，縮短轉化時間，提高轉化質量，為體外大量獲得NSCs提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM/F12，DMEM(Hyclone公司);胎牛血清(PAA公司);陽離子脂質體lipofectamine2000及Opti-MEM(Invitrogen公司);胰酶、膠原酶、抗生素、DMSO(Gibco);成纖維母細胞生長因子(FGF)-b，表皮細胞生長因子(EGF)，胰島樣生長因子(IGF)-1，干細胞因子(SCF)均購自Miltenyi公司;骨形成蛋白(BMP)4購自invitrogen公司。shR-377載體(上海吉瑪生物制藥公司構建);細胞培養箱(THERMOFORMA);實時定量PCR儀(ABI公司);流式細胞分析儀(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HADMSCs分離培養及鑒定 成人脂肪取自吸脂手術患者(中國醫學科學院整形醫院)，與供者簽訂知情同意書，供者均為25～35歲的健康女性。吸脂術采集的脂肪組織用PBS(含100 U/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素)反復清洗，洗去血細胞和麻醉藥，加入1∶1體積的0.2%Ⅰ型膠原酶37℃恒溫水浴鍋內振蕩消化1 h，此時液面分為3層，上層為黃色油狀脂肪細胞層，中層為脂肪組織層，下層為含單個核細胞的膠原酶層，100目濾網過濾至50 ml離心管，離心1 400 r/min×10 min后棄上清，用PBS洗2遍以除去膠原酶，離心收集細胞。分離出的單個細胞以2×106/ml的密度接種于 HADMSCs培養基中，37℃、5%CO2的培養箱培養。24 h首次換液，去除未貼壁細胞，以后每2～3 d換液一次。使用倒置顯微鏡觀察生長情況，對連續傳20代細胞的生長、增殖形態、有無分化進行觀察、攝像。

1.2.2 HADMSCs的表型鑒定 胰酶消化HADMSCs并吹打為單個細胞，每個樣本的細胞數量至少為1×106/ml，分別與CD29-PE、CD45-FITC、CD44-PE、CD117-FITC 標記的單克隆抗體室溫避光孵育30 min，流式緩沖液洗滌3次，FACScalibur流式細胞儀檢測。

1.2.3 shR-377聯合細胞因子誘導HADMSCs向NSCs定向分化 將已經鋪好的6孔板中培養基換成Opti-MEM培養基，shR-377用Opti-MEM稀釋后，37℃孵育5 min加入6孔板，轉染6 h后換成誘導培養基。并設定熒光標記shR-377的對照組，熒光顯微鏡下觀察轉染效率。實驗分為空白對照組、單轉shR-377組、單用細胞因子組，shR377+細胞因子組。轉染前培養基均為HADMSCs培養基，單轉shR-377組及shR377+細胞因子組轉染shR377，其余兩組未轉染;第一次轉染shR-377 8 h后，空白對照組、單轉shR-377組加入HADMSCs培養基，另外兩組加入誘導培養基A;第二次轉染shR-377 8 h后，空白對照組、單轉shR-377組仍加入HADMSCs培養基，另外兩組加入誘導培養基B。

誘導培養基 A:FGF-b、BMP4、B27、activinA;誘導培養基 B:IGF-1、EGF、SCF、FGF-b，于 37℃、5%CO2繼續培養。從次日起在倒置顯微鏡下對HADMSC向NSCs誘導過程的細胞形態變化進行觀察、攝像。

1.2.4 流式細胞檢測誘導后細胞nestin及轉化率 0.25%胰蛋白酶消化誘導后第1日細胞，用PBS反復洗滌后計數，制成單細胞懸液，每個樣本的細胞數量至少為1×106/ml，與nestin/FITC標記的單克隆抗體室溫避光孵育30 min，流式緩沖液洗滌3次，流式細胞儀檢測。按流式分析所得nestin的陽性率為誘導分化的轉化率。

1.2.5 RT-qPCR檢測誘導后細胞nestin和musashi表達 收集誘導后24 h細胞，提取總RNA，按照試劑說明書，后續RT-qPCR。反應參數:第一步:95.0℃，30 s;第二步:95.0℃，5 s;60.0℃，34 s;第 3 步:95.0℃，15 s;60.0℃，1 min;95.0℃，15 s。

PCR引物使用primer5.0軟件設計，由上海生工生物工程有限公司合成，并經HPLC純化。引物序列:GAPDH正義CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA，反義 TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC，長度598 bp;CD29正義 TCCAAGCAACCTGAGCAAC，反義 GATCTGAGTTCGCACCACTG，長度 238 bp;Nestin正義 AACAGCGACGGAGGTCTCTA，反義 TTCTCTTGTCCCGCAGACTT，長度220 bp;musashi正義 CCCACTACGAAACGCTCCAG，反義 TCGCAGATAACCCGCCTACA，長度193 bp。

1.2.6 免疫細胞化學檢測誘導后細胞nestin 轉染后第3日細胞，添加4%的多聚甲醛(用 PBS溶液稀釋)，室溫固定15 min，漂洗三次，每次10 min，加入0.5%的Triton X-100室溫下浸泡10 min，37℃下用PBS溶液漂洗三次，每次10 min;用含1%BSA(牛血清白蛋白)的 PBS溶液(blocking buffer)封閉細胞，37℃下1.5 h(或者4℃過夜)。加帶熒光的一抗anti-nestin/FITC(用1%BSA稀釋)，4℃孵育2 h，熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學方法 采用SPSS13.0軟件，計量資料用以x±s表示，多組間比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1 HADMSCs形態學特征 倒置顯微鏡下觀察，細胞接種時，培養物中混有部分紅細胞，這些紅細胞隨換液次數的增多而被清除。培養的HADMSCs大部分于24 h內即貼壁，貼壁細胞呈圓形，有小的胞質突起。1 w后以梭形細胞為主，胞質豐富，核大，核染色質細，核仁明顯，可見細胞呈克隆樣生長。傳代細胞在12～24 h內完全貼壁，并開始伸展、分裂。經首次傳代以后，細胞生長速度增快，約3～4 d即可達80%融合。傳代后細胞呈長梭形，呈纖維樣細胞形態，細胞呈平行排列生長或漩渦狀生長，核居中，多數為1個核仁，以一點為中心向四周放射狀分布，圓形或卵圓形混雜生長細胞隨傳代次數減少。

2.2 HADMSCs細胞的表型鑒定 流式細胞儀測定了HADMSCs的表面標志 CD29、CD44、CD45和 CD117，其中 CD45和CD117為陰性。而CD29和CD44為陽性。

2.3 shR-377轉染HADMSCs的轉染效果 倒置熒光顯微鏡下觀察，開啟熒光的暗視野下約95%的細胞都有熒光(圖1B)，與沒有開啟熒光的明視野(圖1A)對比鮮明。說明轉染率達到95%左右，可見所用的轉染試劑和轉染濃度是合適的。

圖1 shR-377轉染效果圖(×100)

2.4 HADMSCs向NSCs定向分化的形態變化 誘導后第1、3、7日在倒置顯微鏡下觀察、攝像:空白對照組(A)及單轉shR-377組(B)細胞形態未見明顯變化，只是細胞生長密度增大;單用細胞因子組(C)細胞形態未見明顯變化，可見部分細胞粘連聚集，少數細胞由原來的菱形、三角形變成長條形;shR-377+細胞因子組(D1):細胞轉染后第1天，細胞核見隆起;shR-377+細胞因子組(D3):轉染后第3天，細胞偽足變細成單極、雙極或多極，單極類似蝌蚪形，折光性增強;shR-377+細胞因子組(D7):轉染后第7天，可見細胞聚集成細胞球，其余細胞也見聚集趨向。

圖2 HADMSCs向NSCs定向分化的形態變化

2.5 RT-qPCR檢測nestin和musashi的mRNA表達 空白對照組高表達CD29，幾乎不表達nesti和 musashi;單轉shR-377組較高表達CD29，低表達nestin和musashi;單用細胞因子組較高表達CD29，低表達nestin和musashi;shR-377+細胞因子組:中等表達CD29，高表達nestin和musashi。見圖3。

圖3 各組誘導后細胞的CD29、nestin、musashi表達水平

2.6 流式細胞儀檢測誘導后細胞nestin及轉化率 以HADMSCs為對照，誘導后NSCs的nestin陽性率為(64.6%±3.2%)，對照組為(0.6%±0.05%)。兩組nestin陽性率比較有顯著性差異(P＜0.01)。初步判斷誘導后細胞是神經干細胞，其轉化率為64.6%±3.2%。

2.7 誘導后NSCs進一步向神經細胞分化形態觀察 把誘導后第7天神經干樣球細胞進一步分化，次日細胞明顯有細長突觸長出，向雙極或多極延伸，類似神經元形態，見圖4。

圖4 由NSCs分化的NCs形態圖(×100)

3 討論

本實驗分離培養HADMSCs有幾點改進:(1)分離中，消化細胞采用膠原酶沒有用胰酶。膠原酶比胰酶對細胞的損傷小很多，這樣使分離得到的HADMSCs具有更好的活性和增殖能力。(2)沒有使用NH4Cl裂解脂肪中摻雜的紅細胞，而利用紅細胞不貼壁的特性，通過換液去除紅細胞，這樣也避免了對HADMSCs的損傷。(3)我們使用含5%FBS、2 ng/ml FGF-b的DMEMF12培養基培養HADMSCs。與大多采用的10%FBS的方法或不加FGF-b的方法比較，細胞活力更好，也更不易分化。

目前對HADMSCs鑒定還沒有統一的標準，但普遍認為，HADMSCs最主要的兩個表面標志是CD29和CD44，我們使用流式細胞儀檢測HADMSCs表面標志物，結果顯示表達CD29和CD44，不表達 CD45和 CD117，HADMSCs分離培養成功與否，主要看細胞分離獲得率、細胞活力、細胞增殖能力和有無分化〔6〕。本實驗改進的分離培養方法，在這幾項上都有進步，為體外無分化擴增ADmSCs建立了一個很好的基礎。

ADMSCs在不同誘導條件下可以向軟骨、脂肪、心肌、平滑肌、肝、內皮和造血細胞分化〔6，7〕。目前ADmSCs向神經細胞的誘導均是在DMEM培養基基礎上，應用EGF或FGF-b等生長因子〔8〕，在高(20%)或低(2%)濃度的胎牛血清條件下，加入一些誘導的藥物，如β－巰基乙醇等誘導神經細胞，無論是誘導效率還是存活時間都不能令人滿意。這就需要尋找新的誘導方法提高轉化效率，我們運用shR-377聯合IGF-1、EGF、FGF-b、SCF、BMP4及activinA等細胞因子進行篩選，重復性很好;從形態學來看，效果非常明顯，2次轉染后次日鏡下觀察，原來菱形、三角形等不規則形狀70%以上都發生明顯變化，細胞核隆起膨脹呈球形，細胞偽足收縮變細，向雙極或多極延伸。收集誘導后第一日的細胞使用流式細胞儀檢測nestin的表達與形態學變化基本吻合，而單轉shR-377和單用細胞因子的誘導效果都不明顯，可見shR-377和細胞因子的聯合是高效率誘導HADMSCs向NSCs分化的一個好的選擇。

本實驗所用shR-377是一種短發夾結構的核酸，源于人體蛋白編碼基因SH3PXD2B第一個內含子部位，與外源短發夾核酸類似。該短發夾核酸的莖部兩條鏈完全互補，促進干細胞分化的原理為shR-377抑制EIA樣的分化抑制因子(EID1)的表達，從而活化組蛋白乙酰化酶CBP/P300的表達。

1 Ji S，Gupta N，Weiss JN.The heart and its nerves:a nervous bond〔J〕．Heart Rhythm，2010;7(4):504-5.

2 Zeng Y，Qu X，Li H，et al.MicroRNA-100 regulates osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by targeting BMPR2〔J〕．FEBSLett，2012;586(16):2375-81.

3 Yang Z，Bian C，Zhou H，et al.MicroRNA hsa-miR-138 inhibits adipogenic differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells through adenovirus EID-1〔J〕．Stem Cells Dev，2011;20(2):259-67.

4 Uchida N.MicroRNA-9 controls a migratory mechanism in human neural progenitor cells〔J〕．Cell Stem Cell，2010;6(4):294-6.

5 Doddapaneni R，Chawla YK，Das A，et al.Overexpression of microRNA-122 enhances in vitro hepatic differentiation of fetal liver-derived stem/progenitor cells〔J〕．JCell Biochem，2013;114(7):1575-83.

6 Zhang HT，Liu ZL，Yao XQ，et al.Neural differentiation ability of mesenchymal stromal cells from bone marrow and adipose tissue:a comparative study〔J〕．Cytotherapy，2012;14(10):1203-14.

7 Zavan B，Vindigni V，Gardin C，et al.Neural potential of adipose stem cells〔J〕．Discov Med，2011;10(50):37-43.

8 Ferroni L，Gardin C，Tocco I，et al.Potential for neural differentiation of mesenchymal stem cells〔J〕．Adv Biochem Eng Biotechnol，2013;129:89-115.