Notch配體Delta-1基因真核表達載體的構建

李 偉 胡紅梅 陳彩芬 黃玉珊

(井岡山大學臨床醫學院口腔系，江西 吉安 343000)

細胞間信號作用的相互影響是細胞增殖和分化的主要調控因素，Notch配體Delta-1信號途徑作為細胞間相互作用的一種主要通路，廣泛存在于各種動物中，是調控包括牙髓干細胞(DPSC)在內的多種干細胞的增殖和分化的信號途徑之一〔1〕。在對干細胞組織工程研究中發現，Delta-1表達增強可影響造血干細胞、DPSC和上皮細胞的增殖和分化，尤其在牙髓組織工程研究中，發現Delta-1在牙髓形成修復性牙本質過程中具有重要意義，DPSC可作為Delta-1基因的受體細胞，與納米羥基磷灰石/膠原復合后具有成牙本質能力〔2〕。因此，Delta-1信號作為一種進化保守性細胞間相互作用機制，可影響發育過程中多種細胞的分化、增強和凋亡。雖然研究發現，Delta-1與牙齒再生中成牙本質細胞分化密切相關，但其對DPSC影響的機制研究甚少，本研究利用基因工程技術克隆Notch配體Delta-1結構基因，構建Notch配體Delta-1基因真核表達載體。

1 材料和儀器

1.1 主要材料 克隆載體pCDNA3.1+，載體抗性Ampicillin，載體長度5.4 kb(上海生工)，pfu高溫DNA聚合酶(北京百川開泰公司)，Taq PCR Master Mix(上海生工)，限制性內切酶HindⅢ，BamHI，dNTP ，T4 DNAligase Buffer ，T4 DNAligase(Promega公司)，DH5α感受態細胞(上海生工)，geneRuler SM0331 marker(MBI公司)，引物設計:oiniga基因分析軟件，參照Genbank上公布的Delta-1的基因序列進行分析后設計102條引物，引物由上海生工公司合成。

1.2 主要儀器 凝膠成像分析系統Bioseep Flexi1000(日本奧林巴斯)，紫外-可見分光光度計(北京普析通用)，酶標儀BIORAD(美國伯樂)，電子天平BSA-124S(德國 SARTORIUS)，全溫度振蕩培養箱FZQ-F100(江蘇太倉華美儀器公司)，超低溫冰箱MDF-U53(日本三洋)，高壓滅菌鍋 LX-B75-IL(北京華泰)，超凈工作臺SW-G-2FD(蘇州凈化)，電熱恒溫鼓風干燥箱SKFG-1(上海璽恒)。

1．3 實驗方法

1．3.1 目的片段的擴增 首先根據目的序列設計實驗方案，參考Genbank上公布的Delta-1的基因序列Delta-1長度為2 190 bp，Delta-1為102條引物，通過PCR的方法擴增出足夠量的目的產物，PCR反應采用的是Pfu高溫聚合酶。PCR各個成分的用量:引物濃度為1 OD溶于400μl ddH2O，Delta-1反應體系:50 μl，引物 Mix(0.4×引物條數)12 μl，dNTP 1 μl(25 mmol/L)，10×Pfu 緩沖液 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O 32μl，引物 Mix為每條引物5μl的混合液;delta-1分3段:1/32，31/62，61/102。PCR 程序:95℃ 預變性 3 min，94℃ 變性30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后延伸 6 min，22 個反應循環。然后以PCR產物為模板，基因的首尾引物作為上下游引物，進行第二次擴增PCR各個成分的用量:(引物濃度為1 OD溶于400μl ddH2O)，反應體系:50 μl，第一輪 PCR 產物(3 個片段)各 2 μl，Delta-1P 12 μl，Delta-1 P 102 2 μl，dNTP 1μl(25 mmol/L each)，10×Pfu 緩沖液 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O34 μl。PCR 程序:95℃ 預變性 3 min，94℃ 變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后延伸 6 min，22 個反應循環。

1．3.2 PCR產物與載體pCDNA3.1+酶切回收 在PCR產物中加入其兩倍體積的上樣緩沖液，即80μl。然后轉入2 ml帶柱子的收集管中，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液。加上樣緩沖液300μl，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液，此時 DNA已經掛在柱子上。加 Wash Solution 700μl，13 000 r/min，離心，棄去收集管中濾液。重復上述步驟，此時已把DNA以外的雜質洗脫完畢，將柱子裝入1.5μl的EP管中，加50 μl，60℃的水洗脫 DNA，13 000 r/min，離心。酶切體系:50μl，delta-1 PCR產物酶切體系:Delta-1 PCR產物20μl，BamH Ⅰ 1 μl(10 U/μl)，HindⅢ1 μl(10 U/μl)，10 倍緩沖液BamHⅠ5μl，ddH2O 23μl，以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應3 h。載體的酶切體系:pCDNA3.1+1.5μg，BamH Ⅰ 1μl(10 U/μl)，HindⅢ 1 μl(10 U/μl)，10 倍緩沖液 BamH Ⅰ10μl，ddH2O補足至50μl，以上體系放入37℃恒溫水浴鍋中反應3 h，將所需目的片段切膠回收備用。

1.3.3 目的片段與載體連接 將回收純化好的目的DNA片段和載體，進行連接，Delta-1目的片段與載體連接體系:20μl，酶切目的片段 8 μl(50 ng)，酶切載體5 μl(100 ng)，10×T4，DNAligase緩沖液 2 μl，T4 DNAligase 1 μl(5 U/μl)，ddH2O 補充至20μl，上述連接混合液16℃水浴2 h即可。

1.3.4 轉化、篩選克隆 通過轉化將載體DNA導入感受態細菌繼而得到含有目的DNA插入的轉化菌株是構建質粒最為關鍵的一步，本次實驗選擇的感受態細菌是DH5α，取一試管感受態細菌DH5α置于冰上進行融化，溶化后取100μl的菌液。將上述連接液轉入DH5α菌液中，輕輕搖動試管以便混勻混合物，冰浴30 min，然后42℃中水浴90 s，冰浴3 min，此過程切勿搖動試管，向離心管中加入500μl的LB液體培養基，混勻后37℃置于搖床上45 min，取已經轉化的感受態細菌DH5α置于LB固定培養基，檢測篩選出陽性克隆進行測序。

2 結果

2.1 PCR產物純化結果 按照Genbank的Delta-1目的片段的相關信息，經過兩輪PCR擴增出Delta-1目的片段的基因片斷，PCR產物經1.9%瓊脂糖凝膠電泳，純化，長度為2 190 bp(圖1)。實驗所用的Marker是MBI公司的SM0331(圖2)，Delta-1目的片段序列見圖3。

圖1 MBI公司的SM0331

圖2 Delta-1 PCR產物純化，長度為2 190 bp

圖3 Delta-1的基因序列

2.2 PCR產物與載體pCDNA3.1+酶切結果 通過PCR產物與載體pCDNA3.1+酶切結果來看，PCR擴增出Delta-1目的片段長度為2 190 bp，pCDNA3.1+酶切后的長度為5.4 kb，長度符合要求，酶切電泳圖，見圖4、圖5。

2.3 Delta-1基因真核表達載體的構建的酶切圖 重組質粒pCDNA3.1+-Delta-1提取純化后的酶切圖譜顯示，pCDNA3.1的長度為5.4 kb，Delta-1的長度為2 190 bp，已經成功地構建了質粒，見圖6。

圖4 Delta-1酶切電泳圖

圖5 PCDNA3.1+酶切電泳圖

圖6 成功構建的p CDNA3.1+-Delta-1質粒酶切圖

3 討論

臨床上由于牙體缺損或牙列缺損是人類健康所面臨的主要危害之一，最大限度恢復患者的口腔生理咀嚼狀態和功能已成為口腔臨床醫生關注的熱點，組織工程再生牙齒的研究常以干細胞、生物支架及信號分子為基礎。2000年Gronthos等〔3〕體外培養人牙髓細胞，發現通過分離的人牙髓細胞具有克隆形成能力、高增殖率，命名為DPSC，其后許多學者利用DPSC在大鼠和家兔體內、體外進行了相關研究，均成功形成反應性牙髓-牙本質復合體樣結構，為進一步研究牙齒的再生的可能性提供了強大的實驗基礎。Notch配體Delta-1信號途徑，作為細胞間相互作用的一種主要通路，是調控細胞增殖和分化重要的信號途徑之一，但其對DPSC影響如何研究甚少。對牙髓的再生研究中，Spath等〔4〕發現Delta-1表達增強在牙髓受刺激形成修復性牙本質過程及DPSC研究中具有重要意義，DPSC可作為Delta-1基因的受體細胞，與納米羥基磷灰石/膠原復合后具有成牙本質能力。而且發現Delta-1信號與骨形成蛋白之間可能存在相互作用，但Delta-1基因和骨形成蛋白協同作用DPSC形成牙本質能力的機理未完全闡述清楚。國內何飛的研究中發現初步顯示Delta1轉染DPSC具有較單純DPSC更強的牙本質形成能力，表明Delta1可對DPSC作為組織工程種子細胞起到基因強化的效果，為進一步的組織工程牙髓-牙本質復合物相關研究奠定新的實驗基礎〔5〕。

因此，對DPSC等種子細胞進行基因修飾，促使其定向分化為牙齒組織甚至組織工程牙齒，就具有重要的理論意義和迫切的實踐意義，本課題組在前期的實驗中成功分離鑒定出人DPSC的基礎上，進行構建pCDNA3.1+-Delta-1質粒的相關研究，以便對下一步的DPSC的增值和分化的研究奠定實驗基礎。pCDNA3.1是由pCDNA3衍生而來的大小約5.4 kb的DNA序列，可以在哺乳動物體內高度穩定的短暫表達，在大多數哺乳動物細胞內都可以穩定的非復制性的表達。由于pCDNA可以保證目的基因的高水平穩定的表達，本次實驗利用其作為載體來進行pCDNA3.1+-Delta-1質粒的研究，發現合成的質粒穩定，酶切圖譜清晰，且方便目的基因的篩選及復制，對細胞染色體不產生副作用，是一種方便有效的質粒合成載體。

綜上所述，本課題通過將Delta-1基因與PCDNA3.1構建成真核表達載體，經過生物軟件測序及Genebank的分析等鑒定，證實成功獲得pCDNA3.1+-Delta-1質粒，本課題組將在隨后的研究中，對DPSC的增殖和分化進行進一步的研究，為牙齒的再生研究將奠定良好的實驗基礎。

1 Lovschall H，Tummers M，Thesleff I，et al．Activiation of the Notch signaling pathway in response to pulp capping of rat molars〔J〕．Eur J Oral Sci，2005;113(4):312-7.

2 Lovschall H，Mitsiadis TA，Poulsen K，et al．Coexpression of Notch3 and Rgs5 in the pericyte-vascular smooth muscle cell axis in response to pulp injury〔J〕．Int JDev Biol，2007;51(8):715-21.

3 Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al．Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and in vivo〔J〕．Proc Natl Acad Sci USA，2000;97(25):13625-30.

4 Spath L，Rotilio V，Alessandrini M，et al．Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials〔J〕．Cell Mol Med J，2010;14(6B):1635-44.

5 何 飛，楊崢嶸，譚穎徽，等.Delta1基因轉染人牙髓干細胞牙本質形成能力的研究〔J〕．中國修復重建外科雜志，2007;21(10):1133-6.