廣西壯族人群散發性帕金森病PARK2和LRRK2基因的多態性

龐國防 梁慶華 呂澤平 胡才友 黃東挺 周博峰 黃春麗 余天智 唐鳳川 潘尚領 彭均華

(廣西自壯族自治區江濱醫院神經內科，廣西 南寧 530021)

5%～10%的帕金森病(PD)患者表現為常染色體顯性或隱性遺傳，因此，對遺傳易感基因的篩查成為近期研究PD的熱點之一〔1〕。歐洲、美洲人群及日本等東亞主要群體的病例-對照研究及全基因組關聯分析結果顯示，帕金森病蛋白(PARK)2和富亮氨酸重復激酶(LRRK)2基因的一些單核苷酸多態性(SNP)分別在常染色體隱性早發(50歲前發病)及常染色體顯性晚發(50歲后發病)PD的發病中可能扮演重要的角色，而且呈現明顯的群體及地域特異性〔2～4〕。至今 PARK2及 LRRK2基因已發現約150個 SNPs與PD關聯〔2〕，其中部分 SNP已在沈陽、江蘇、湖南等地區的漢族人群中得到重現〔5～7〕。羅曙光等〔8〕也發現該基因第10外顯子的V380L多態性與廣西地區漢族女性PD的遺傳易感性有關。但至今，壯族群體PD的遺傳流行病學尚無報道。本研究結合東亞人群常見的PD相關基因變異，對廣西壯族散發性PD患者PARK2及LRRK2基因5個SNP進行基因分型，了解這些基因多態性與廣西壯族PD發病的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 (1)PD組:2011年5月至2013年12月我院收治的散發PD患者，無明顯家族史，共112例，年齡(64.29±12.93)歲，其中男59例，女53例，均為壯族，主要來自南寧及周邊的百色、河池等地區，并以50歲為界分為早發及晚發亞組。均符合1992年英國帕金森病協會及中華醫學會神經病學分會運動障礙及帕金森病學組制定的診斷標準〔11，12〕，由兩位資深神經內科醫生共同確定診斷。(2)對照組:為來自相同地區，年齡、民族、性別構成與PD組匹配的健康中老年人156例，年齡(62.85±11.62)歲，男84例，女72例。研究對象除了詳細的神經系統檢查外，常規的體格檢查及身高、體重、血壓等臨床數據亦一并采集。研究對象均知情并同意。PD組的飲酒比例、BMI、收縮壓、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)均明顯大于對照組(均P＜0.05)，而吸煙的比例小于對照組(P＜0.05)，兩組性別構成及年齡構成、舒張壓、低密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 所有研究對象禁食12 h后于清晨空腹采肘靜脈血8 ml，其中3 ml ACD抗凝血用于白細胞基因組DNA提取，5 ml非抗凝血分離血清后用于血脂測定。

1.2.2 DNA提取 采用經典的酚-氯仿法。

1.2.3 血脂測定 血清TC、TG采用酶法，HDL-C、LDL-C采用酶聯免疫一步法，試劑盒購自申能試劑公司。

1.2.4 SNP基因分型 采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(PCR-RFLP)進行分型，引物參考文獻〔7～10〕進行設計，由上海生工公司合成。各SNP的基本特征、引物序列、PCR退火溫度、內切酶種類、酶切產物大小等數據見表1。PCR反應總體積為20μl，其中2×Taq Master Mix(北京康為世紀生物科技有限公司)10 μl，上、下游引物(0.2 μmol/μl)各1 μl，Taq DNA 聚合酶〔寶生物工程(大連)有限公司〕1 U，基因組 DNA 200 ng(1μl)及ddH2O 7μl。SNP rs1801582的 PCR條件:94℃預變性5 min后，94℃變性 40 s，59℃ 退火 40 s，72℃ 延伸 50 s，35 個循環，再72℃延伸10 min。取10μl PCR產物加入0.2 U限制性內切酶Bsp1286 I〔寶生物工程(大連)有限公司)，72℃水浴消化4 h，然后取酶切產物8μl在2%瓊脂糖凝膠中80 V電泳30 min。rs1801582的PCR產物為165 bp，酶切產物電泳后僅出現1條帶者(165 bp)為GG野生純合型，出現3條帶型(165，107，58 bp)者為GC雜合突變型，出現2條帶型(107，58 bp)者為CC純合突變型。其余4個SNP的PCR-RFLP體系、條件及帶型特點見表2。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0軟件。本研究中TG為正偏態資料，對數轉換后為正態分布，以中位數表示，P值均已經對數轉換，其余符合正態分布的計量資料以±s表示。基因頻率用直接計數法計算。Hardy-Weiberg平衡采用擬合優度χ2檢驗。兩組計量資料的組間比較采用t檢驗，兩組以上比較采用方差分析。分類資料組間比較采用χ2檢驗。

表1 研究對象的基本臨床特征(±s)

表1 研究對象的基本臨床特征(±s)

臨床特征 PD組(n=112)對照組(n=156)P值64.29±12.93 62.85±11.62 0.045性別〔n(%)〕 男 59(52.7) 84(53.8) 0.96女53(47.3) 72(46.2)年齡〔n(%)〕 ≤50歲 42(37.5) 76(48.7) 0.062＞50歲 70(62.5) 80(51.3)吸煙〔n(%)〕 是 29(25.9) 59(37.8) 0.002否83(74.1) 97(62.2)飲酒〔n(%)〕 是 20(17.9) 19(12.2) 0.039否92(82.1) 137(87.8)BMI(kg/m2) 22.51±3.43 21.14±3.17 0.041收縮壓(mmHg) 136.23±28.14 129.45±25.31 0.034舒張壓(mmHg) 87.21±13.65 84.76±12.28 0.056 TC(mmol/L) 5.08±1.01 4.91±0.94 0.038 TG(mmol/L) 0.97(0.49) 0.93(0.47) 0.026 HDL-C(mmol/L) 1.58±0.38 1.62±0.37 0.122 LDL-C(mmol/L)年齡(歲)3.00±0.86 2.82±0.80 0.017

表2 各SNP的基本特征及基因分型策略

2 結果

5個SNP的分布均符合H-W平衡。在PARK基因的多態位點rs45530340，T等位基因攜帶者罹患PD的風險約為正常人群的2.252倍(95%CI:1.186～3.517，P=0.009)。無論早發、晚發或總體，PD組的CT雜合基因型頻率及T等位基因頻率均明顯高于對照組的相應亞組(P＜0.01～0.05)，PD組內的早發及晚發亞組基因型頻率及等位基因頻率無明顯差別(P＞0.05)。在LRRK2基因的rs34778348位點，A等位基因攜帶者罹患PD的風險也明顯升高(OR=1.632，95%CI:1.238～2.346)，但 P值稍弱，總體上PD組等位基因A及純合突變型AA的頻率高于對照組(P＜0.05)。另3個SNP的基因型和等位基因頻率分布兩組間無差異(P=0.445～0.894)。見表3。

表3 廣西壯族人群散發性PD的相關基因及致病基因〔n(%)〕

3 討論

PARK2基因也稱為parkin或E3泛素蛋白連接酶基因，全長超過500 kb，包含12個外顯子。Parkin可催化泛素分子與特異性底物的結合，并通過泛素-蛋白酶體系統降解這些目標底物〔9〕。早發性PD患者多數有PARK2基因的多重突變，而且這些突變會影響PARK2的一個或多個功能區并導致PARK2的功能改變〔2〕。LRRK2基因位于染色體12q，全長145 kb，包括51個外顯子，編碼含2575個氨基酸的dardarin蛋白(震顫蛋白)，其功能涉及到底物的結合、底物的磷酸化、蛋白-蛋白之間的交互作用等。例如，它直接使絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt1(亦稱蛋白激酶B1)磷酸化而活化Akt1，而后者是生長激素及其受體之間信號轉導的關鍵分子。正常的Akt1磷酸化/去磷酸化是確保神經細胞生存及凋亡平衡的重要基礎。LRRK2的錯義突變可導致不同程度的病理過程，例如R1441C、G2019S和I2020T突變明顯減少Akt1的磷酸化，引起神經細胞的退行性改變，因此LRRK2被認為是家族性及散發性PD的重要分子〔11，12〕。

本研究的主要發現是，在廣西地區壯族散發性PD患者中，PARK2 rs45530340(L63V)及LRRK2 rs34778348(G2385R)的頻率明顯高于對照組，攜帶rs45530340 T等位基因及rs34778348 A等位基因的個體患PD的風險是普通人群的2.252倍及1.632倍，但基因型及等位基因頻率在早發和晚發PD之間無差異。因此，這兩位點可能是壯族散發性PD的易感因素之一。此結果與張學偉及Zhou等〔5，6〕報道的西南漢族及沈陽漢族的結果基本一致，而與趙輝等〔7〕報道的淮海地區漢族有所不同，后者PARK2 rs45530340 T等位基因的頻率雖與本結果類似，但PD組與對照組之間無差異(16.4%vs 20%，P=0.251);而在LRRK2 rs1491942位點，PD組的C等位基因頻率明顯高于對照組(43.4%vs 32.8%，P=0.006)。可見，PD與 PARK2及LRRK2基因的關聯存在明顯的群體特異性。

一些學者認為，PARK2基因的單堿基突變可導致早發性PD或是晚發PD的危險因素〔13〕。Wang等〔14〕在果蠅模型上發現，過度表達PARK2 R275W突變的個體呈現明顯的多巴胺能神經退行性變和線粒體異常，與敲除Parkin基因的果蠅的表現相似，說明PARK2在維持線粒體功能穩定性方面起著重要的作用。但PARK2單堿基突變導致PD的病理遺傳學機制尚有待進一步闡明，尤其對于多重雜合突變的個體，因為這些突變可能存在潛在的交互作用〔15〕。本研究中，雖然rs1801582在PD和對照人群中無明顯差異，但卻存在較高的GC雜合基因型頻率，而且PD組PARK2 rs45530340雜合基因型CT的頻率明顯高于對照組，故不排除這兩個雜合變異間的交互作用。

LRRK2被認為是家族性及散發性PD的重要分子〔6〕。本組病例LRRK2 rs34778348(G2385R)等位基因A攜帶者罹患PD的風險明顯高于普通人群，與中國西南漢族及東亞主要群體的結果類似〔7，16〕。此位點位于LRRK2基因第48外顯子的WD40結構域，使第7153號核苷酸G變成A，相應密碼子GGG變成GGA，編碼同樣的氨基酸Gly，被認為是一種沉默的、中性的點突變，在多個西方群體中沒發現PD患者與普通對照間的頻率差異〔2〕。本組人群及其他東亞群體PD患者高頻等位基因A的潛在生物學意義尚不清楚，與其他未知的致病突變存在連鎖不平衡可能是其解釋之一。本組病例沒發現LRRK2 rs7133914(R1398H)的頻率在兩組人群中的差異，與 Chen等〔17〕報道的華南漢族的結果一致，但他們把已報道的其他漢族群體的結果合并后再分析發現，R1398H有降低PD風險的作用。他們認為，R1398H可能降低了Akt1激酶的活性而發揮其保護作用。至于其如何降低Akt1激酶的活性，目前還不清楚，可能是因為 R1398H位于 ROCO基序中的 ROC結構域，而ROCO具有鳥嘌呤酶活性，LRRK2負責ROC與無活性的GDP和有活性的GTP之間的切換，即當ROC結構域與GTP與結合時，LRRK2的活性增加，而與GDP結合時，活性降低。更重要的是，LRRK2與GTP或GDP結合主要取決于ROC的功能狀態〔17〕。本研究沒發現PARK2 rs1801582(V380L)在病例組及對照組之間的差異，與羅曙光等〔8〕報道的廣西漢族群體的結果有所不同，這可能與兩個研究樣本大小、民族構成不同等有關。

本研究只檢測華人群體常見的與PD關系較為密切的PARK2和LRRK2變異，故不能排除壯族PD患者這兩個基因是否還攜帶其他的變異或存在其他基因重排。

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