不同水平高血壓患者血清Klotho蛋白、NO、ET-1的表達水平及相關性

張歡歡 韓 冰 廉銀珠 趙慧穎 (吉林大學第一醫院老年病科，吉林 長春 3002)

研究表明內皮素(ET)和一氧化氮(NO)參與高血壓的發生和發展過程。Klotho作為新發現的抗衰老基因，研究表明其與體內多種血管活性物質相互作用，具有保護血管內皮、舒張血管、促進血管新生、抗動脈硬化等作用〔1〕。目前關于血清Klotho蛋白與血壓水平及高血壓發病機制的關系尚不明確。本研究旨在探討不同程度高血壓患者血清Klotho蛋白、NO、ET-1的表達與高血壓的關系及其相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2011年8～11月在我院心血管疾病診治中心住院患者96例及體檢中心的健康對照者30例。入組時均經過詢問病史、體格檢查、X線檢查、心電圖、超聲心動圖檢查、相關實驗室檢查等。采用水銀柱血壓計測量患者右側上臂血壓。將患者按血壓水平分為對照組30例，收縮壓(SBP)＜140 mm-Hg和舒張壓(DBP)＜90 mmHg;高血壓1級組31例，SBP 140～159 mmHg和(或)DBP 90～99 mmHg;高血壓2級組33例，SBP 160～179 mmHg和(或)DBP 100～109 mmHg;高血壓3級組32例，SBP≥180 mmHg和(或)DBP≥110 mmHg。入選標準:①年齡18～75歲。②符合第7版《內科學》定義的高血壓標準。③血、尿、糞常規、肝、腎功能、電解質檢測均正常。④既往有高血壓，但未服藥治療或未規律服藥治療，現血壓仍≥140/90 mmHg。排出標準:①患者既往有高血壓病史，正在使用降壓藥物治療，目前血壓＜140/90 mmHg;②患有急慢性肝、腎疾病、腫瘤、冠心病、腦血管病、周圍血管疾病、自身免疫性疾病、其他感染性疾病;③血、尿、糞常規、肝、腎功不在正常范圍;④繼發性高血壓患者。各組間年齡及性別分布不存在顯著性差異(P＞0.05)。見表1。

1.2 標本的采集 采集所有患者清晨空腹肘靜脈血液3～5 ml，3 000 r/min離心10～15 min，吸取上清液于EP管密閉保存，-80℃冰箱保存待測。

1.3 試劑與方法 人血清Klotho蛋白、ET-1定量檢測采用酶聯免疫吸附(ELISA)法，試劑盒購于上海源葉生物科技有限公司。血清NO測定采用硝酸還原酶法，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。使用上海第三分析儀器廠提供的721分光光度計，按說明書提供的計算公式計算結果。應用生化自動分析儀檢測空腹血糖、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)等，均在我院檢驗科生化室完成。

1.4 統計學方法 應用SPSS20.0軟件，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，兩變量之間關系采用Pearson線性相關或Spearman相關分析;計數資料組間比較采用χ2檢驗。

表1 各組間的一般情況(±s)

表1 各組間的一般情況(±s)

項目 對照組(n=30)高血壓1級組(n=31)高血壓2級組(n=33)高血壓3級組(n=32)54.47±9.7 52.74±6.6 53.30±8.1 55.91±10.4男性〔n(%)〕 17(56.7) 16(51.6) 15(45.5) 15(46.9)空腹血糖(mmol/L)5.46±0.50 5.95±1.07 6.18±1.50 6.35±1.51 TG(mmol/L) 1.91±0.97 1.70±1.00 2.17±1.21 2.06±1.38 TC(mmol/L) 4.32±0.75 5.07±0.89 4.93±1.28 4.79±0.92 LDL-C(mmol/L)2.75±0.62 3.09±0.73 3.16±0.96 3.14±0.85 HDL-C(mmol/L)年齡(歲)(±s)0.11±0.29 1.37±0.34 1.21±0.34 1.16±0.40

圖1 血清Klotho蛋白與NO水平之間的相關性

2 結果

2.1 各組Klotho蛋白、NO、ET-1水平比較 隨血壓水平升高，血清Klotho蛋白及NO水平逐漸降低，Klotho蛋白在高血壓1級組與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，余組間比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，NO水平在任意兩組間比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)。ET-1水平隨血壓水平升高而逐漸升高，高血壓3級組、2級組分別與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.05)，高血壓3級組與1級組相比有顯著性差異(P＜0.05)，余組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。見表2。

2.2 血清Klotho蛋白、NO、ET-1含量分別與血壓水平的相關性 隨著血壓水平升高，血清Klotho蛋白、NO含量逐漸降低，且均與血壓水平呈負相關(r=-0.470，-0.813，均P＜0.000 1)。ET-1含量隨血壓水平升高而逐漸升高，與血壓水平呈正相關(r=0.288，P＜0.01)。

表2 四組間Klotho蛋白、NO、ET-1水平比較(±s)

表2 四組間Klotho蛋白、NO、ET-1水平比較(±s)

與高血壓1級組比較:1)P＜0.05;與高血壓2級組比較:2)P＜0.05;與高血壓3級組比較:3)P＜0.05

組別 n Klotho蛋白(pg/ml)NO(μmol/L)ET-1(μmol/L)對照組 30 146.82±20.52)3)65.1±12.81)2)3)176.44±37.72)3)高血壓1級組 31 142.23±21.3 56.85±11.5 179.94±53.3高血壓2級組 33 128.16±23.71) 45.03±6.171) 202.99±54.7高血壓3級組 32 115.27±23.11)2)29.67±7.41)2)209.49±45.51)

2.3 血清 Klotho蛋白、NO、ET-1水平之間的相關性 采用Pearson檢驗，Klotho與ET-1之間無相關性(r=-0.154，P=0.086)，采用Spearman檢驗，發現Klotho蛋白與NO之間呈正相關(r=0.408，P＜0.000 1)，NO與ET-1之間呈負相關(r=-0.266，P=0.003)。見圖1，圖2。

2.4 Klotho蛋白與血糖間的相關性 Klotho蛋白與空腹血糖之間不存在相關性(r=-0.053，P=0.559)。

2.5 Klotho蛋白與血脂間的相關性 Klotho蛋白與TG、HDLC之間無相關性(r=-0.095，-0.018，均 P＞0.05)。Klotho蛋白與TC、LDL-C之間存在負相關(r=-0.182，-0.199，均P＜0.05)。見圖3，圖4。

圖2 血清NO與ET-1水平之間的相關性

圖3 血清Klotho蛋白與TC之間的相關性

3 討論

目前認為血管內皮損傷是心血管疾病的重要病理生理基礎〔2〕，研究〔3〕表明血管內皮功能障礙是高血壓最早期和最重要的血管損害。VEC可合成多種血管活性物質，對血管平滑肌的收縮、舒張活動起調節作用，其中最重要的有ET-1和NO。ET-1是目前已知最強烈的縮血管活性多肽，其可作用于平滑肌細胞的ET受體A(ETA)，促進鈣離子釋放，增強細胞外的鈣離子內流，使血管強烈收縮，從而導致外周血管阻力(SVR)升高〔4〕。NO是主要由NO合成酶(NOS)催化L-精氨酸生成，可使血管平滑肌細胞內鈣離子濃度減低，導致血管舒張，引起SVR降低。此外，NO可抑制血管壁及循環血中的一些活性因子作用，發揮抑制血管平滑肌細胞增生、防止內皮損傷及動脈硬化形成等功能〔5〕。Klotho基因是由 Kuro-o等〔1〕發現的一種抗衰老基因，主要在腎臟和腦脈絡膜高表達，動物實驗證實Klotho基因的正常表達可抑制并逆轉動脈硬化等病理生理過程，如降低血壓、防止動脈內膜增厚及血管纖維化等。Aizawa等〔6〕首次報道了血清Klotho蛋白的濃度隨高血壓的發展而呈逐漸下降的趨勢。

本研究結果可能是原發性高血壓患者血清Klotho蛋白濃度降低，引起血管內皮功能障礙及動脈硬化，從而導致血壓升高。隨著血壓水平升高，血管內皮功能障礙逐漸加重，使NO合成及分泌減少，導致血清NO水平逐漸降低。Mizuno等〔7〕研究發現長期高血壓持續循環壓力應激可導致自發性高血壓大鼠(SHR)體內Klotho基因的表達下調。何亞軍等〔5〕研究發現高血壓組Klotho蛋白吸光度和NO水平較非高血壓組明顯降低。有研究報道血漿Klotho蛋白水平隨年齡增加而降低〔5〕，本實驗在除去年齡、性別等因素后，Klotho蛋白與血壓水平仍呈負相關，推測內源性Klotho蛋白減少可能是高血壓發生、發展的獨立危險因素。本研究結果顯示血清ET-1水平隨血壓水平升高而逐漸升高，與血壓水平呈正相關，分析原因為當血壓升高時，VEC損傷導致血管內皮功能紊亂，再生大量的ET-1，而引起血壓持續升高。王國戧等〔8〕的研究顯示血漿ET-1水平與高血壓分級呈正相關，與本實驗研究結果一致。

圖4 血清Klotho蛋白與LDL-C之間的相關性

本研究分析了Klotho蛋白、NO、ET-1三者的相關性，分析其原因為血壓升高時內源性Klotho蛋白分泌減少，且血壓升高導致VEC功能障礙引起NO合成及釋放減少，而ET-1的合成及釋放增多。Saito等〔9〕的動物實驗證實Klotho基因缺陷可引起NO合成減少，并發現Klotho基因的正常表達可改善血管內皮功能，增加NO的產生，降低血壓，防止內膜增厚和血管纖維化。何亞軍等〔5〕研究指出Klotho蛋白可能通過調節NO的含量維持血壓穩定。根據目前研究結果，推測Klotho蛋白可能通過改善內皮功能、調節內源性NO釋放途徑調節血壓，但Klotho蛋白調節NO釋放的具體機制有待進一步研究。有假說認為Klotho蛋白可能通過調節NOS的活性來調節NO的釋放。研究發現NO可通過下調血管緊張素(Ang)Ⅱ1型受體基因表達，使AT 1-R數目下調而抑制血管平滑肌細胞的增殖，從而抑制ET-1分泌〔10〕。當Klotho蛋白水平下降，NO水平隨之下降，解除對ET-1的抑制作用，ET-1合成及釋放增多。田鵬等〔11〕研究發現Klotho和ET-1呈負相關。而本實驗研究未發現Klotho蛋白與ET-1之間存在相關性，可能與樣本量較小有關。

Aizawa等〔6〕的研究發現高血壓患者血清Klotho蛋白的濃度與血清TC呈負相關，本研究結果與其一致。推測Klotho蛋白可能參與了血脂代謝調節。國外有研究提示Klotho基因的多態性與脂代謝存在相關性〔12〕。劉曉林等〔13〕研究表明Klotho基因G-395A SNP、F352V SNP與高血壓及血脂有相關性。故對Klotho基因多態性的研究可能有助于早期發現及診治高血壓、脂代謝紊亂高危人群。

綜上所述，監測Klotho蛋白、NO、ET-1水平可能對今后高血壓的防治、預后判斷具有指導意義。目前國內有研究顯示福辛普利能夠上調Klotho的表達〔14〕，故那些能夠調節Klotho基因啟動子活性、上調Klotho蛋白表達的物質，無疑將成為治療高血壓的新途徑。

1 Kuro-o M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997;390(6655):45-51.

2 Sadik NA，Mohamed WA，Ahmed MI.The association of receptor of advanced glycated end products and inflammatory mediatom contributes to endothelial dysfunction in a prospective study of acute kidney injury patients with sepsis〔J〕.Mol Cell Biochem，2012;359(1-2):73-81.

3 陸再英，鐘南山，謝 毅，等.內科學〔M〕.北京:人民衛生出版社，2011:252-4.

4 Pelosi G，Emdin M，Carpeggiani C，et al.Impaired sympathetic response before intradialytic hypotension:a study based on spectral analysisof heart rate and pressure variability〔J〕.Clin Sci，1999;96(1):23-31.

5 何亞軍，蘇顯明，王新陽.Klotho蛋白在高血壓發病中的作用〔J〕.西安交通大學學報(醫學版)，2010;31(4):434-6.

6 Aizawa H，Saito Y，Nakamura T，et al.Downregulation of the Klotho gene in the kidney under sustained circulatory stress in rats〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1998;249(3):865-71.

7 Mizuno I，Takahashi Y，Okimura Y，et al.Upregulation of the klotho gene expression by thyroid hormone and during adipose differentiation in 3T3-L1 adipocytes〔J〕.Life Sci，2001;68(26):2917-23.

8 王國戧，楊彩玲，郭麗娟.不同血壓水平人群血管危險因子檢測及其臨床意義探討〔J〕.檢驗醫學，2014;29(3):254-7.

9 Saito Y，Nakamura T，Ohyama Y，et al.In vivo klotho gene delivery protects against endothelial dysfunction in multiple risk factor syndrome〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2000;276(2):767-72.

10 梁偉鈞，李果明，陳建英.高血壓病患者血漿內皮素和一氧化氮含量的變化及其意義〔J〕.廣東醫學院學報，2004;22(4):337-8.

11 田 鵬，汪 漢，李 璐，等.Klotho基因對自發性高血壓大鼠內皮功能的影響〔J〕.生物醫學工程學雜志，2011;28(3):526-30.

12 Shinoyama Y，Tak IK，Mitsuda Y，et al.KLOTHO gene polymorphisms G-395A and C 1818T are associated with low-density lipoprotein cholesterol and uric acid in Japanese hemodialysis patients〔J〕.Am JNephrol，2009;30(4):383-8.

13 劉曉林，馬厚勛.Klotho基因3個SNP位點與老年高血壓及脂代謝的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(23):3429-32.

14 李湘民，周巧玲.福辛普利對自發性高血壓大鼠腦超微結構及Klotho基因表達的影響〔J〕.中國動脈硬化雜志，2010;18(4):273-8.