小麥及其近緣物種中類燕麥儲藏蛋白Avenin瞝ike基因的克隆綜述

摘要 介紹了小麥的品質及品質的形成、小麥的儲藏蛋白及儲藏蛋白的分類。綜述了近年來關于類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因發現、Avenin-like基因的胚乳特異性表達的時空表達模式以及Avenin-like基因的啟動子的作用元件和時空表達特異性研究。

關鍵詞：Avenin-like基因；胚乳特異性表達；啟動子

中圖分類號：S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-040-03

小麥的品質主要包含營養品質和加工品質[1]。其中小麥的營養品質主要是指所含的營養物質對生物體營養需要的適合性和滿足程度，包括營養成分含量的多少和各種營養成分是否全面和均衡。小麥的加工品質是指小麥籽粒對制粉以及制作不同食品的適應性和滿足程度，主要包括一次加工品質即磨粉品質和二次加工品質即食品加工品質。磨粉品質是指籽粒在輾磨為面粉的過程中，品質對磨粉工藝的滿足程度，主要包括籽粒容重、灰分、硬度、出粉率、面粉白度等。小麥的食品加工品質包括烘烤和蒸煮后的質量，烘烤品質主要指出粉率、灰分、粉色、細度、沉降值、α-淀粉酶活性等指標，蒸煮品質主要指吸水率、攪拌特性、面筋延伸性和抗延性[2]。物質組成決定加工品質，小麥加工品質很大程度上取決于面團流變學特性，與小麥儲藏蛋白的組分關聯密切[3-8]。

面粉加水之后經過攪拌后形成面團，其大致的分子機理為：谷蛋白亞基通過分子間二硫鍵交聯，然后形成纖維狀大分子聚合體，從宏觀上表現為彈性的形成。醇溶蛋白在分子內在二硫鍵、氫鍵等的共同作用下形成球狀結構，通過非共價鍵穿插在谷蛋白網絡構架中，在宏觀上表現為面團具有延展性[9]。面團的彈性和黏性用面團的流變學特性來描述。

1924年，Osborne[10]根據種子中貯藏蛋白的溶解條件，將貯藏蛋白分為兩大類。其中第一大類為面筋蛋白，主要含有麥谷蛋白和麥醇溶蛋白。麥谷蛋白約占45%，可以溶于稀酸或稀堿，由17～20條多肽鏈構成，呈纖維狀，水合時無黏性，彈性好，決定面團彈性。麥醇溶蛋白約占40%，醇溶性，由一條多肽鏈構成，僅有分子內二硫鍵和較緊密的三維結構，呈球形，多由非極性氨基酸組成，富含谷氨酰胺和脯氨酸，故水合時黏性好，參與面團延展性[11]。第二大類主要為非面筋蛋白，主要包括清蛋白和球蛋白。清蛋白可溶于水或低濃度鹽溶液，約占蛋白總量的2.5%；球蛋白可溶于稀釋的鹽溶液中但不能溶于水，約占蛋白總量的5%。

1 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因及蛋白的發現

1.1 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因的發現 2001年，Anderson等[12]將小麥授粉后的種子與種子胚乳特異性EST進行雜交，其cDNA文庫是小麥授粉后5～30 d的種子cDNA文庫，發現了一類新的小麥胚乳特異性表達基因，然后BLAST對比分析，證明該小麥胚乳特異性表達的基因與燕麥Avenin儲藏蛋白基因相似度最高。

2004年，Li等[13]分別以小麥的胚、胚乳以及未授粉子房的RNA反轉錄的DNA為探針，與小麥授粉后12 d的種子cDNA文庫進行差異雜交，結果證明4個基因類似于燕麥Avenin蛋白編碼基因，并研究了這類小麥Avenin-like蛋白編碼基因在各個組織中的表達模式，進一步證明了該類基因只在胚乳中特異性表達。

2005年，Vensel等[14]通過質譜技術以及雙向電泳技術，將小麥開花后10～36 d的胚乳中分離出的蛋白質經序列比較分析后發現了5個類似于燕麥的蛋白質，通過研究證明該類蛋白質是小麥新型種子儲藏蛋白。

2005年，Drea等[15]應用高通量原位雜交技術，檢測小麥胚乳發育早期基因表達模式，將檢測到種子發育期間有多個Avenin-like蛋白編碼基因在胚乳中特異性表達，這些表達產物被證明類似于小麥儲藏蛋白。

2005年Dupont等[16]從小麥種子胚乳中分離得到一個新型蛋白質，然后通過試驗表明小麥胚乳中這類蛋白與燕麥Avenin蛋白相似度很高。

1.2 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like蛋白的研究 2006年，Kan等[17]利用構建的小麥和山羊草開花后14 d的種子cDNA文庫與小麥胚乳特異性表達的EST芯片雜交，結果顯示為陽性克隆，將陽性克隆的基因序列和推導的蛋白質序列經BLAST比較分析后，因這種基因與小麥儲藏蛋白基因Avenin同源性較高，故將這種基因命名為Avenin-like基因，將其相應的蛋白命名為Avenin-like蛋白。

依據Avenin-like蛋白的結構差異，可以分為Avenin-like type a和Avenin-like type b 2種蛋白，分別含有約148和265個氨基酸殘基，分子量分別約為16 kDa和30 kDa[17]。已分離的小麥Avenin-like type a基因Avenin-like type b基因長度分別為450和855 bp。

2008年，陳鵬等[18-19]利用小麥及其近緣物種各種山羊草為研究材料，克隆得到了23個ALP type-b同源基因，然后利用半定量PCR技術及Western-blot雜交分析驗證，結果表明，該基因在胚乳中特異性表達。并證明這些Avenin-like蛋白存在典型的“半胱氨酸-半胱氨酸”，即“Cys-Cys”結構域。陳鵬等[20-21]利用實時熒光定量即RT-PCR技術證明Avenin-like基因的時空表達模式，Avenin-like基因在根、莖、葉、花等其他組織中均無表達，但在胚乳中特異性表達。

2 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因的啟動子研究

2.1 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因啟動子的克隆和元件分析 基于類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因在胚乳中特異性表達的特性，2012年，宋斐等[22]對ALP type-B基因啟動子的克隆及其功能進行了研究。

采用實時熒光定量PCR即RT-PCR分析發現，ALP type-B基因在小麥胚乳中表達，但在根、莖、葉和花等其他組織中均無表達，表明ALP type-B基因的表達具有胚乳特異性。運用反向PCR技術，從小麥鄂恩1號中克隆得到ALP type-B基因的上游1.664 bp啟動子序列。應用PLACE和plantCARE等數據庫分析了該1.664 bp啟動子元件，發現該啟動子除具備啟動子的基本元件TATA-box、CAAT-box外，還含有胚乳特異性表達的元件，如GCN4元件、TGTAAAG元件、Skn-motif元件、AACA元件等[23]（圖1）。

基于對啟動子順式作用元件序列的生物信息學分析，為了進一步分析鑒定上述啟動子元件的作用，以載體pBI121為基本框架，構建了包括ALP type-B基因上游1，664 bp序列及4個分別含有不同序列長度的5′端缺失啟動子序列999、785、550和290 bp在內的5個雙元表達載體，并以其長度為基礎分別命名為載體pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3，表達載體的報告基因均是GUS基因（圖2）。

2.2 類燕麥儲藏蛋白Avenin-like基因啟動子的特異性表達分析 將上述5個pALP-17、pALP-10、pALP-8、pALP-6和pALP-3雙元表達載體轉化于煙草中，獲得了轉基因植株，其中轉化pALP-3、pALP-8和pALP-10表達載體的轉基因煙草陽性植株各5株，轉化pALP-6表達載體的轉基因煙草陽性植株4株，轉化pALP-17表達載體的轉基因煙草陽性植株19株。

對獲得的T0代陽性轉基因煙草植株進行GUS組織化學檢測，進行定性研究，其原理是報告基因GUS（β-葡聚糖苷酶）可將X-Gluc水解成藍色物質，因此具有GUS活性的部位或位點呈現藍色或藍色斑點，可用肉眼或顯微鏡觀察到。證實ALP type-B基因啟動子可驅動報告基因在煙草胚乳中表達，但在煙草其他組織如根、莖、葉和花中并未檢測到報告基因GUS基因的表達。然后對轉基因煙草進行GUS熒光定量分析，其中轉化有pALP-3的種子GUS活性達到273.06 nmol/（mg蛋白·hr），這個值是陰性對照種子[14.25 nmol/（mg蛋白·hr）]的近20倍，說明prolamin-box元件可以保持啟動子驅動報告基因在胚乳中本底水平的表達；同時研究證明隨著啟動子序列長度的增加，至-785 bp啟動子驅動報告基因達到最高GUS活性即447.86 nmol/（mg蛋白·hr），推測ESP-like元件與RY motif元件可能共同作用構成一個強胚乳特異性上調元件；而后則逐漸降低直至173.68 nmol/（mg蛋白·hr），由此推測在-785 bp啟動子上游和下游，分別有較強的下調和上調順式作用元件，而G-box并未發揮其遠端上調作用[22]。

3 需要進一步研究的工作

對各顯著啟動子元件進行缺失突變分析和點突變分析，并對含有潛在的顯著上調、下調順式作用元件的區段進行更加精細地截取并進行轉基因研究。

以轉基因小麥為材料，通過凝膠組織分析鑒定具有顯著上調、下調作用順式作用元件的特異結合蛋白，以期找到新的反式作用因子，為深入研究小麥胚乳特異性表達調控機制提供新方向。

通過基因槍法將pALP-17載體轉入小麥，進一步明確該小麥ALP type-B基因啟動子在禾本科植物中的表達特性，為該啟動子在基因工程中的應用奠定基礎。

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