續骨酒質量標準研究

胡翼安等

摘要 [目的]建立續骨酒的定量定性檢測方法，為續骨酒質量控制提供理論依據。[方法]采用薄層色譜法（TLC）對續骨酒中的梔子、地黃定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測定梔子苷的含量。[結果]TLC鑒別分離度好、專屬性強；含量測定中梔子苷在0.151 1～2.518 0 mg范圍內呈良好線性關系，線性回歸方程為Y=925 558X- 11 386，r=0.999 9（n=7），平均回收率為99.4%，RSD%為1.4。[結論]該試驗所建立的方法簡便、準確、專屬性強、精密度高、重復性好，可作為續骨酒的質量控制方法。

關鍵詞：續骨酒；質量標準；地黃；梔子苷

中圖分類號：S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-047-03

續骨酒是廣州市正骨醫院的一個常用制劑。續骨酒主要由鬧羊花、續斷、梔子、姜黃、生地黃、獨活等中藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛、驅風祛濕、舒筋通絡的功效，對各種骨折腫痛、跌打損傷、風濕骨痛有確切的療效。續骨酒是一安全、有效、使用方便的外用噴霧劑，很受患者歡迎，卻至今缺乏一個全面、完善的質量標準。現行的續骨酒內控質量標準中只有2010年版中國藥典中有關噴霧劑通則項下的檢查，包括外觀、總固體、乙醇量、裝量、微生物限度等項目，這些檢查項既不能保證制劑的質量，亦保障不了臨床用藥的有效性和安全性，因此很有必要對續骨酒中的藥材和有效成分進行鑒別，并測定其有效成分的含量，以提高續骨酒的質量和臨床用藥的有效性。筆者采用薄層色譜法對梔子、地黃進行定性鑒別，用高效液相色譜法對續骨酒中梔子苷進行了含量測定，為續骨酒質量標準的制定提供一定的科學依據，也為續骨酒后期在臨床上的發展應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器 島津高效液相色譜儀（LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測器、CTO-10ASvp柱溫箱、CBM-20A控制器、SIL-20A自動進樣器，LC solution化學工作站）；KQ-300型超聲波清洗器（功率300 W，頻率40 kHz，東莞市科橋超聲波設備有限公司）；AUW220D型萬分之一分析天平（日本SHIMADZU公司）；Goodlook-1000型薄層色譜成像系統（上海科哲生化科技有限公司）；薄層層析硅膠G板（德國MACHEREY-NAGEL公司，批號006153）。

1.2 試藥 梔子對照藥材（批號120986-201309，中國藥品生物制品檢定所），地黃對照藥材（批號121180-201005，中國藥品生物制品檢定所），梔子苷對照品（批號110749-201316，中國藥品生物制品檢定所）；續骨酒（廣州市正骨醫院，批號20140101、20140201、20140301、20140401、20140501）和續骨酒梔子陰性溶液（廣州市正骨醫院）；甲醇為色譜純，其余為分析純。

1.3 方法

1.3.1 梔子的TLC鑒別 。取本品20 ml，蒸干，加乙醇2 ml使溶解，作為供試品溶液；取缺梔子的陰性對照樣品20 ml，同法制成缺梔子陰性對照溶液；再取梔子對照藥材1 g，加50%甲醇10 ml，超聲40 min，濾過，取續濾液作為對照藥材溶液；另取梔子苷對照品，加乙醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法[1]試驗，吸取上述供試品溶液和陰性對照溶液各4 ml、對照藥材溶液及對照品溶液各2 ml，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）為展開劑[2]，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點清晰。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，應分別顯相同顏色的斑點，陰性對照應無干擾。

1.3.2 地黃的TLC鑒別。取續骨酒原液作為供試品溶液。取地黃對照藥材1 g，加80%甲醇50 ml，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 ml使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次10 ml，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇2 ml使溶解，作為對照藥材溶液。按照薄層色譜法試驗[1]，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各5 ml，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）為展開劑[3]，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點清晰。在日光下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，應分別顯相同顏色的斑點，應陰性對照無干擾。

1.3.3 梔子苷的含量測定。

1.3.3.1 色譜條件與系統適用性試驗。色譜柱為迪馬ODS色譜柱（250×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（20∶80），流速1.0 ml/min；柱溫30 ℃；檢測波長237 nm。理論塔板數按梔子苷峰計算應不低于3 000。

1.3.3.2 供試品溶液的制備。精密吸取續骨酒10 ml，置于25 ml容量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45 mm孔徑微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

1.3.3.3 對照品溶液的制備。取梔子苷對照品適量，精密稱定，置于50 ml容量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含251.8 mg/ml的對照品溶液；精密吸取上述對照品溶液5 ml，置于20 ml容量瓶，加入甲醇至刻度，搖勻，制得含62.94 mg/ml的梔子苷對照品溶液。

1.3.3.4 陰性對照溶液的制備。按缺梔子的陰性對照樣品，按“1.3.3.2”項下方法制備，即得缺梔子陰性對照溶液。

1.3.3.5 測定方法。分別精密吸取供試品溶液及對照品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。

1.3.3.6 標準曲線的制備及線性考察。精密吸取梔子苷對照品溶液（251.8 mg/ml）各0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，分別注入高效液相色譜儀，按“1.3.3.1”色譜條件進行測定并繪制標準曲線。

1.3.3.7 穩定性試驗。將按“1.3.3.2”項制備的供試品溶液（批號20140101）于0、2、4、8、12、24 h分別進樣10 μl，按“1.3.3.1”色譜條件測定。

1.3.3.8 精密度試驗。精密取梔子苷對照品溶液10 μl，采用高效液相色譜法，連續測定6次。

1.3.3.9 重復性試驗。取供試品溶液（批號20140101）按“1.3.3.5”項下方法，連續測定6次。

1.3.3.10 加樣回收試驗。在已知含量的續骨酒加入一定量的梔子苷對照品溶液，按“1.3.3.5”項下方法測定，并計算回收率。

1.3.3.11 樣品測定。精密稱取續骨酒樣品，按“1.3.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μl，采用高效液相色譜法測定。

2 結果與分析

2.1 梔子的TLC鑒別 從圖1可以看出，供試品色譜中，在與梔子對照藥材色譜和梔子苷對照品色譜相應的位置上，分別顯相同顏色的斑點，缺梔子陰性對照品色譜相應的位置上沒有干擾。

2.2 地黃的TLC鑒別 從圖2可以看出，在與地黃對照藥材色譜顯相同顏色的斑點，缺地黃陰性對照品色譜相應的位置上沒有干擾。

2.3 梔子苷的含量測定

2.3.1 色譜條件及系統適應性試驗。在該色譜條件下檢測，繪制供試品、梔子苷對照品和缺梔子陰性對照品色譜圖（圖3）。由圖3可見，供試品和梔子苷對照品在相同的保留時間（32.5 min），缺梔子陰性對照品在相對應的保留時間沒有影響。供試品所測定主峰附近無明顯雜峰，經計算，樣品主峰與其他組分峰的分離度>1.5。

2.3.2 標準曲線的制備及線性考察。通過“1.3.3.1”色譜條件測定梔子苷對照品，以梔子苷進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得出線性回歸方程為Y=925 558X- 11 386（r=0.999 9），結果表明，梔子苷在0.151 1～2.518 0 mg范圍內呈良好的線性關系。

2.3.3 穩定性試驗。按“1.3.3.7”項，分別于0、2、4、8、12、24 h測定續骨酒中的梔子苷。測得24 h內平均峰面積為662 523，RSD=2.1%（n=6），表明被測樣品在24 h內穩定。

2.3.4 精密度試驗。按“1.3.3.8”項，連續測定6次，測得平均峰面積為590 545，RSD=1.1%，表明在此試驗條件下精密度良好。

2.3.5 重復性試驗。按“1.3.3.9”項，連續測定6次。測得同一批號中，平均峰面積為660 066，梔子苷平均濃度為173.7 μg/ml，RSD=1.2%，結果顯示重復性良好。

2.3.6 加樣回收試驗。由表1可見，該試驗方法中梔子苷的平均回收率達99.4%，RSD為1.4%，表明該方法準確、可靠，可用于續骨酒中梔子苷的含量測定。

2.3.7 樣品測定。由表2可知，3批續骨酒中梔子苷含量為155.1～176.6 μg/ml，平均含量為163.6 μg/ml，RSD為0.20%～0.49%。

3 小結與討論

（1）梔子的薄層色譜鑒別中，按藥典方法的展開系統分離效果較差，經查閱文獻，改用乙酸乙酯-丙酮-氨水-甲醇-水（5∶5∶1∶0.5∶0.5）為展開劑，結果顯示斑點清晰、分離度好，可作為續骨酒的定性鑒別指標。

（2）地黃的薄層色譜鑒別中，按藥典方法的展開系統分離效果較差，斑點模糊，經查閱文獻，改用正丁醇-冰醋酸-水-甲醇（6∶3∶3∶2）為展開劑，結果顯示斑點清晰、分離度好，可作為續骨酒的定性鑒別指標。

（3）該研究采用HPLC法測定了續骨酒中梔子苷的含量，樣品分離度高，測定方法重復性良好、回收率高、專屬性強，可作為該制劑質量控制的含量測定指標。

（4）該研究測得續骨酒中梔子苷的平均含量為163.6 μg/ml，考慮到藥材來源、制劑生產等因素，暫規定本品每毫升中含梔子以梔子苷（C17H24O10）計，不得少于90 μg/ml。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社， 2010：231， 附錄34-35.

[2] 方道碩， 鐘亞玲， 宋英. 清熱瀉火膠囊的質量標準[J]. 中國藥師， 2008， 11（4）： 406- 408.

[3] 馮文濤， 謝穎， 張榕. 涼血顆粒所用藥材的薄層鑒別[J]. 華西藥學雜志， 2008， 23（4）： 502.