生物發酵床養豬墊料中營養成分和微生物群落研究

趙國華　方雅恒　陳貴

摘要 [目的] 探討發酵床養豬模式下不同使用年限微生物群落的變化以及不同使用時間、不同深度的發酵床墊料中墊料組分的變化。[方法] 采用常規分析方法測定樣品中的營養成分含量，對不同年限樣品中微生物分離提純后，結合16S rRNA分子生物學鑒定對其微生物群落進行分析。[結果] 隨著發酵床使用時間的延長，墊料中的總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分和粗蛋白含量均顯著增加，而水分含量降低不明顯；使用1年和2年的墊料從上層到下層總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低，不同使用時間、不同深度發酵床墊料中糞尿組水分、總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分、粗蛋白均高于其他組。隨著使用年限的增加，豬生物發酵床墊料中微生物群落的多樣性有降低的趨勢。芽孢桿菌屬細菌和梭菌屬細菌在1年期樣品和2年期樣品中都是優勢菌，對豬生物發酵床墊料中有機質的降解發揮著重要的作用。[結論]該研究可為墊料的資源化合理利用提供理論依據。

關鍵詞：發酵床；微生物；多樣性；成分

中圖分類號：S188+.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-098-02

規模化的養殖推動了我國農業經濟的發展，但是隨之帶來的環境污染問題也越來越引起人們的重視。發酵床養殖作為新型養殖技術，自從引入我國后被大力地推廣和使用，為解決畜牧環境污染問題帶來了新途徑。發酵床養豬技術是基于控制畜禽糞便排放與污染的一種新型環保型養殖技術，將鋸末、稻殼、秸稈等材料接種土著微生物菌種，堆積發酵后用作墊料，在經過改造的豬舍內加入上述有機墊料制成發酵床。在發酵床上養豬，糞尿會被墊料吸附，微生物降解其中的有毒有害物質，同時利用產生的生物熱殺滅糞便中的腸道寄生蟲卵，從而達到降低養殖舍內有害氣體濃度、減少養殖污染排放以及提高豬的生長性能的目的[1-3]。發酵床養殖技術的核心是墊料中微生物群落的活動。筆者通過監測嘉興某發酵床養豬場生長肥育豬舍使用1年2年的不同深度發酵床墊料中營養物質成分（水、粗蛋白、粗灰分、鈣）的變化以及氮、磷、鉀含量的變化，探索墊料中這些元素的累積情況及動態變化規律，并通過對豬生物發酵床樣品進行基因組DNA提取、16S rRNA擴增、測序分析等，了解豬生物發酵床微生物的動態變化規律，以期為墊料的資源化合理利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 發酵床樣品均來由金鴻牧業有限公司提供。第1年和第2年的發酵床，采用對角線采樣法分別采集5個點的樣品（其中包含糞尿區）[3]，每個點分別從上至下用刀取0～15 cm（上層）、30～40 cm（中層）和60～70 cm（下層）的墊料樣品，同一深度各2.0 kg樣品混合，然后再采用四分法取500 g，備用。糞尿點各層單獨取樣各2.0 kg，單獨混勻。混合方法：將取得的每層墊料樣品混在一起，用四分法選取500 g，置于自封袋中密封，防止水分揮發，置于有冰袋的保溫盒中，貼上標簽迅速帶回實驗室備用。

1.2 墊料的測定指標及方法 水分含量測定：采集回的墊料用四分法選取500 g，先將墊料置于65 ℃烘箱烘至恒溫，用飼料粉碎機粉碎后通過40目篩，混勻樣品，裝入廣口瓶中貼上標簽保存，待進行其他各項指標測定。墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的測定方法參考《土壤農業化學分析方法》[4]。全氮和全磷含量分別采用半微量凱氏定氮法和鉬黃顯色光度法測定；全鉀含量采用原子吸收分光光度法測定。

1.3 培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉50.0 g、瓊脂20 g，蒸餾水溶解定容至1 L，調節pH至7.6，于121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.4 微生物的分離、純化及保存 試驗中分別用牛肉膏蛋白胨培養基、高氏一號培養基從稀釋的豬生物發酵床樣品中選擇性地分離細菌和放線菌，以供細菌16S rDNA分子生物學鑒定。

1.5 細菌16SrDNA片段的擴增 以細菌通用引物 27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TACGGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′為引物，豬生物發酵床分離培養的細菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR 擴增反應體系（50 μl）：25 μl 2×MightyAmp Buffer Ver.2（含Mg2+、dNTP plus），正反向引物各15 pmol，基因組DNA（直接挑菌作為基因組DNA模板），MightyAmp DNA Polymerase 1 μl。

PCR反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min， 30個循環；最后68 ℃延伸10 min。

PCR反應結束后，取PCR產物5 μl和2 μl上樣緩沖液混勻后點樣于濃度1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，于90 V電壓下電泳30 min。電泳結束后，立即在瓊脂糖凝膠成像系統下觀察，拍照并存盤。

1.6 細菌RFLP酶切分型分析 克隆后，對陽性克隆子進行PCR擴增，然后使用限制性內切酶對擴增產物酶切，酶切DNA片段進行瓊脂糖凝膠電泳，所得DNA帶型圖譜通過凝膠分析軟件進行比對，然后選取不同的操作單元，并將對應的陽性克隆子送交測序公司測序。

1.7 Blast比對 將測序結果在核酸數據庫（GenBank）中進行Blast。

2 結果與分析

2.1 不同深度發酵墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的變化 由表1可知，2年間不同深度發酵床墊料中，糞尿組水分含量均顯著高于其他組。使用第1年和第2年的發酵床墊料水分含量變化差異不顯著，這可能與發酵床墊料管理得好及定期深翻墊料有關。隨著墊料深度的增加，水分含量逐漸降低。墊料中的粗灰分主要來源于墊料組分及豬不斷排泄的糞污。該試驗結果表明，隨著墊料深度的增加，墊料粗灰分含量逐漸下降，這主要是由于豬的糞尿主要集中在表層的緣故。對比第1年和第2年的數據發現，墊料中粗灰分的濃度逐漸升高，表明粗灰分有累積作用。糞尿組各層顯著高于其他組。隨著墊料深度的增加，墊料中粗蛋白的濃度逐漸降低，這是由于糞尿中含有一定量的含氮化合物，因而墊料表層粗蛋白含量最高。隨著墊料使用時間的延長，墊料中粗蛋白的濃度逐漸升高，表明粗蛋白具有累積作用。糞尿組顯著高于其他組。

2.2 2年間不同深度發酵床墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣含量 發酵床墊料中的總氮、總磷、總鉀和鈣含量主要來源于2個方面：一方面是墊料中的鋸末、秸稈和稻殼，另一方面是豬糞污。飼料中的營養成分被豬消化吸收后，排泄物主要是以糞污的形式不間斷排泄。由表2可知，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度隨墊料使用時間的延長逐漸升高。隨著墊料深度的增加，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低。糞尿組上、中、下層總氮、總磷、總鉀、鈣的濃度均明顯高于其他組上、中、下層。這表明豬的習性是群居，這不利于充分利用發酵床的功能特性。該試驗結果與其他研究結果一致[5-7]。

2.3 微生物總基因組DNA 將所采集到的樣品經過前處理后，提取微生物總基因組DNA并進行純化，再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖1可以看出，微生物總基因組DNA完整、無拖尾和雜帶，能滿足后續試驗要求。

2.4 保育期不同年限樣品的16SrDNA序列比對結果 將保育1年、保育2年的樣品分別與GeneBank 進行Blastn序列比對，發現保育期1年的樣品微生物（相似度達99%）主要有：芽胞桿菌屬（Bacillus sp）、產堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、破傷風桿屬（Clostridium sp.），藤黃單胞菌屬（Luteimonas sp.）、外硫紅螺菌屬（Ectothiorhodospria sp.）、海桿菌屬（Marinobacter sp.），假單胞菌屬（Pseudomonas sp）和索氏菌屬（Thauera sp）等。保育期2年的樣品中微生物（相似度達99%）主要有：芽胞桿菌屬（Bacillus sp.）、破傷風桿屬（Clostridium sp.）、Uncultured bacterium，細桿菌屬（Microbacterium sp）、節細菌屬（Arthrobacter sp）、鏈霉菌屬（Streptomyces sp）、芽胞八疊球菌屬（Sporosarcina sp.）、寡養單胞菌屬（Stenotrophomonas sp.）等。生物發酵床保育1年樣品中與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）相關的克隆子數有36個，占所有克隆子數的28.57%；與破傷風桿屬（Clostridium sp.）相關的克隆子有32，占所有克隆子的35.40%，因此樣品中芽孢桿菌屬和破傷風桿屬占優勢。生物發酵床保育2年期樣品中克隆子較多的序列歸屬于芽孢桿菌屬和破傷風桿屬有克隆子27個和23個，分別占21.60%和18.40%，在樣品中占有優勢，為優勢菌。

芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭菌屬（Clostridium）在生物發酵床保育期樣品中發揮著重要的作用，與其他研究結果相一致[8-9]。另外，有幾個序列與已知的細菌序列沒有任何的相似性，它們在生物發酵床中的作用還需要進一步研究。

3 小結

（1）不同使用時間、不同深度發酵床墊料中，糞尿組水

分、粗灰分、粗蛋白、總氮、總磷、總鉀和鈣含量均顯著高于其他組。

（2）從豬生物發酵床樣品中分離到的16SrDNA序列可以看出，隨著發酵床使用年限的增加，發酵床內的微生物群落也在不斷地更替演變，保育2年時微生物群落的減少，說明隨著使用年限的增加，豬生物發酵床墊料內的微生物群落的多樣性有降低的趨勢。在保育期樣品中，芽孢桿菌屬和梭菌屬始終是獨立的的分支，對發酵床物質代謝和能量代謝發揮著巨大的作用。

參考文獻

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