食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法比較研究

曹建平　韓丹　王健

摘要：[目的] 探求一種適應食品微生物實驗室檢驗要求的快速準確的方法。[方法]比較研究Baird-Parker平板法、MPN法、科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基法和PetrifilmTM測試片法這4種定量方法對金黃色葡萄球菌的選擇性、靈敏度和在食品中的應用。[結果]試驗顯示，4種方法檢測金黃色葡萄球菌選擇性良好；MPN法、顯色培養基法和紙片法靈敏度比Baird-Parker平板法稍高；4種方法應用在食品檢測中，金黃色葡萄球菌檢出率無顯著差異。因此可選擇顯色培養基和PetrifilmTM測試紙片法作為日常檢驗的輔助手段，以提高檢測靈敏度、縮短檢驗周期。[結論] 研究可為食品檢測方法的研究及應用積累一定的經驗，為今后金黃色葡萄球菌的檢測工作提供一定參考。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；定量檢測方法；比較研究

中圖分類號：S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-242-02

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬，是一種重要的病原菌，是典型的革蘭氏陽性菌，有較強的抵抗力。金黃色葡萄球菌營養要求不高，且有高度的耐鹽性，容易污染肉類、水產品、乳品等食品，在世界各個國家中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細菌性食物中毒中均占較大比例[1-2]，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已成為世界性的公共衛生問題。

目前關于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測方法主要有Baird-Parker平板計數法[3]、MPN計數法[3]、測試紙片法[4]、顯色培養基計數法等。其中Baird-Parker平板計數法和MPN計數法為國標法的第二法和第三法，但兩者都存在耗時、工作量大的缺陷，很難適應現在快速檢驗要求；測試紙片法、顯色培養基計數法檢測周期短、工作量小，已經得到了很多機構的認可。筆者比較研究了這4種定量方法對金黃色葡萄球菌的選擇性、靈敏度和在食品中的應用，以Baird-Parker平板計數法為基準，將結果進行比較分析研究，旨在探求一種適應食品微生物實驗室檢驗要求的快速準確的方法，為食品檢測方法的研究及應用積累一定的經驗，為今后金黃色葡萄球菌的檢測工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及培養基。

平板計數瓊脂、營養肉湯、BHI肉湯、Baird-Parker瓊脂基礎、卵黃亞碲酸鉀增菌劑、凍干血漿，青島海博生物技術有限公司；革蘭氏染色液，北京陸橋；科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基，法國科瑪嘉公司；PetrifilmTM6491金黃色葡萄球菌測試片、PetrifilmTM6493金黃色葡萄球菌確認反應片，美國3M公司。

1.1.2 試驗菌株。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、表皮葡萄球菌（ATCC29069），寧波市鄞州區食品檢測中心提供。

1.1.3 樣品。

采集寧波市農貿市場及超市的食品50份， 其中生肉類10份、熟肉制品10份、生牛奶10份、豆制品10份、糕點10份。

1.2 試驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的檢驗。Baird-Parker平板計數法：按GB 4789.10-2010第二法檢驗。

MPN法：按GB 4789.10-2010第三法檢驗。

科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基平板法：每個稀釋度分別吸取1 ml樣品勻液以0.3、0.3、0.4 ml接種量分別加入3塊顯色培養基平板上，然后用無菌L棒涂布整個平板，注意不要觸及平板邊緣，按說明書判讀。

PetrifilmTM測試片計數法：取1 ml稀釋好的菌液接入測試片，靜置測試片1 min，（36±1）℃培養24 h，按說明書判讀，有可疑菌落時，用確認反應片做補充試驗。

1.2.2 選擇性鑒定試驗。

將3株試驗菌株分別劃線接種于Baird-Parker平板和顯色培養基平板；MPN法的鑒定同Baird-Parker平板；以生理鹽水作10倍系列稀釋，取1 ml接種PetrifilmTM測試片（使菌液終濃度在100～1 000 CFU/ml）；36 ℃培養24～48 h，觀察各菌株的典型生長情況，并進行特異性比較。

1.2.3 靈敏度試驗。

在4種培養基上加入不同菌濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液，每個測試作2個平行，按“1.2.1”方法培養，判讀，計數，同時以平板計數瓊脂傾注法計算菌濃度作對照，評價4種試驗方法的檢測靈敏度。

1.2.4 食品中檢測應用 。

無菌生理鹽水作10倍系列稀釋同一樣品后，選擇適當的稀釋度分別按“1.2.1”方法檢測，結果用SPSS 18.0軟件以χ2檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 選擇性試驗比較 3株試驗菌株中，金葡菌在4種培養基中生長良好（MPN法最終也是用BP平板篩選），特征菌落明顯，表皮葡萄球菌在4種培養基中雖然有生長，但無典型特征性菌落，大腸埃希氏菌在4種培養基中均不生長，結果見表1。分析結果得出，各種培養基對金葡菌的選擇性都良好，符合計數培養基的選擇性要求。

2.2 靈敏性試驗 用4種檢測方法分別對金葡菌進行計數，MPN法、顯色培養基法和PetrifilmTM測試片法靈敏度比Baird-Parker平板法稍高一個數量級，但均能滿足計數要求，結果見表2。

2.3 食品中金黃色葡萄球菌檢出結果分析 50批樣品中金葡菌的檢出率如表3所示。顯色培養基法、MPN法和紙片法檢出率分別為24%、22%和22%，結果差不多，檢出率比Baird-Parker平板法的稍高。但通過SPSS統計分析表明，MPN法、顯色培養基法、紙片法和Baird-Parker平板法無顯著差異（χ2=2.64<χ20.05，12，P>0.05）。

2.4 金黃色葡萄球菌各種定量檢驗方法比較 對檢測金黃色葡萄球菌幾種方法指標的評價見表4。Baird-Parker法需涂布后觀察然后挑去可疑菌落轉接BHI肉湯后，再做血漿凝固酶進行證實試驗，耗時3～4 d。MPN法更是需要對樣品先進行增菌，然后再接種觀察培養驗證，耗時更長，步驟更是繁瑣、量大。顯色培養基、測試片法是基于微生物自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應顯色的原理，顯色培養基臨用前加熱煮沸溶解即可使用，接種后24 h觀察結果，無需證實試驗；紙片法只需培養后對可疑菌落加確認反應片驗證即可對最終結果進行判定。在實際檢驗運用中，顯色培養基、測試片法較傳統培養基有工作量少、使用簡便、靈敏度高、周期短的優點，但顯色培養基和測試片成本要比Baird-Parker法和MPN法高。

3 結論與討論

金黃色葡萄球菌其菌落有典型的金黃色特征，是食源性致病菌的一種，但在日常檢測過程中，常會造成金黃色色素不典型的現象，若單純使用傳統Baird-Parker平板和血平板，容易造成誤判，張琳從BP平板上隨機挑取典型菌落做血漿凝固酶驗證試驗，結果檢出率為66%[5]，這一結果與一文獻中報道的相符合[6]，這漏檢往往會導致食品安全事故。Baird-Parker法涂布時受人員熟練程度等人為因素影響，菌落有時分布不均勻而難以計數。當樣品中金葡菌濃度低時，Barid-Parker法和MPN法結果沒有顯著差異，但Barid-Parker法更接近理論值，一般不選擇MPN法[7]。科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養基可直觀上對幾種葡萄球菌進行有效區分，避免了漏檢和誤判，節省了檢測時間。PetrifilmTM測試片，操作步驟標準化，人為誤差較小，攜帶方便尤其適合現場取樣檢驗。但測試片法計數時，黑色或藍綠色的可疑菌落較多，而紫紅色菌落相對較少，加確認片反應后，也只有少量菌落有粉紅色暈圈。因此使用測試片法計數時，如雜菌過多，則將會影響結果，建議同時多做幾個稀釋度。

通過比較，雖然顯色培養基法及測試片法成本較高，但金黃色葡萄球菌的檢出率與傳統國標法即Barid-Parker平板法和MPN法相比無顯著差異，卻極大地縮短了檢測時間，且操作簡便。在實際檢測工作中，可將選擇顯色培養基和PetrifilmTM測試紙片法作為日常檢驗的輔助手段，在實驗室檢驗中推廣應用。

參考文獻

[1] 李自然，施春雷，宋明輝，等.上海市食源性金黃色葡萄球菌分布狀況[J].食品科學，2013，34（1）：268-271.

[2] 陳廣全，張惠媛，曾靜.食品安全檢測培訓教材 微生物檢驗[M].北京：中國標準出版社，2010：351-352.

[3] 中華人民共和國衛生部.GB 4789.10-2010.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗 [S].北京：中國標準出版社，2010

[4] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.SN/T 1895-2007 食品中金黃色葡萄球菌的快速計數法PetrifilmTM 測試片法[S].北京：中國標準出版社，2007.

[5] 張琳.食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的比較研究[J].食品工業科技，2006，27（6）：166-169.

[6] SCHOELLER N P，LNGHAM S C.Comparison of the Baird-Parker agar and 3MTM Petrifilm rapid S.aureus count plate methods for detection and enumeration of Staphylococcus aureus[J]. Food Microbiol， 2001，18：581-587.

[7] 陸嵐，張勇，張勇琪，等.金黃色葡萄球菌定量檢驗方法研究[J].大家健康，2011，5（11）：39-40.