水稻4個生長時期莖部可培養內生菌多樣性分析

王雪君等

摘 要 為了解水稻不同生長時期內生細菌的動態變化及其多樣性，以水稻品種明恢63（MH63）為研究對象，種植于海南省三亞市連作水稻試驗田中，分別于水稻幼苗期、分蘗期、開花期和結實期（2014年1月到4月份）分離莖部可培養內生細菌。結果表明：共獲得了細菌域4個門6個綱51個屬99個種共計529株分離菌株，其中幼苗期分離到23個屬33個種，分蘗期分離到30個屬44個種，開花期分離到15個屬20個種，結實期分離到20個屬29個種。上述4個生長時期均分離到伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、草螺菌屬（Herbaspirillum）和黃桿菌屬（Flavobacterium），且以伯克霍爾德氏菌屬為優勢菌屬。多樣性指數排序：分蘗期>幼苗期>結實期>開花期；優勢度指數排序：開花期>結實期>幼苗期>分蘗期。水稻莖部內生細菌具有較豐富的遺傳多樣性，不同生長期的種群數量、優勢度存在差異，開花期優勢菌群集中，優勢屬突出，優勢度較高；而分蘗期優勢度較低，但種群種類較豐富，且分布均勻。

關鍵詞 水稻；內生細菌；不同時期；多樣性

中圖分類號 S511；Q939.11 文獻標識碼 A

Abstract To understand the biodiversity and distribution of endobacteria in rice though the whole grow stages， we isolated and identified the endobacteria from rice cultivar Minghui 63（MH63）crossing the whole growth stages including seedling stage， tillering stage， flowering stage and productive stage. The rice endobacteria（529 isolates in total）belong to 4 phylums， 6 classes， 51 genus， and 99 species. Among them， 33 species （23 genus） were isolated from rice seedling stage； 44 species （30 genus） were isolated from rice tillering stage；20 species（15 genus）were isolated from rice flowering stage； and 29 species （20 genus） were isolated from rice productive stage. The dominated class is Burkholderia， leading Herbaspirillum and Flavobacterium which consistently present in all growth stages. Shannon-Wiener index（H′）revealed that H′tillering>H′seedling>H′productive>H′flowering. Simpson index（D） revealed that Dflowering>Dproductive>Dseedling>Dtillering. Our study inferred that the rice endobacteria were diversity， the Shannon-Wiener index and Simpson index was difference between the growth stages. Additionally， we found that the most diversified endobacteria presented in tillering stage， which suggested the interaction between endobacteria and plant might more activate. Less diversity was found in flowering stage indicated that flowering stage have more dominant species.

Key words Rice（Oryza sativa）；Endobacteria；Four growth stages；Diversity

植物內生細菌生活在宿主體內的特殊環境中，對植物的生長發育和生態功能產生重要影響[1]，包括為宿主植物提供激素，促進植物生長[2]、植物殘骸的生物降解[3]、植物重金屬污染的修復[4]及植物芳香族化合物的降解[5]，也可作為生物防治菌抵抗病菌[6]和蟲害[7]，或作為生物肥料增加產量[8]，以及提高宿主植物的抗逆性[9]等。內生菌多樣性的研究對探索植物-微生物互作機制、反應宿主植物生長情況、提高宿主抗病和抗逆境的能力、開發可作為生物肥料及具有生防載體菌的生物資源等具有重要意義。

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，目前水稻產量的提高主要靠大面積施用化肥和農藥，對環境造成極大的污染。而微生物肥料具有無毒、無污染、作用時間長、成本低等特點，可以彌補化學肥料和農藥的缺點。近幾年植物內生菌逐步作為生物肥料及生防載體菌被加以利用[1]。

目前，國內外研究工作主要集中于不同品種水稻內生菌與品系之間的關系研究[10]，以及內生菌與宿主植物或根際土壤微生物的相互作用[11]，而關于水稻不同生長發育期內生菌群落多樣性的研究以及內生菌對不同時期水稻生長發育的作用和影響報道甚少。黎起秦等[12]對廣西水稻苗期、分蘗期、孕穗期、灌漿期和乳熟期的內生細菌進行了分離鑒定，但分離到的菌種數量較少。本研究通過分離水稻4個主要生長時期的莖組織內生細菌來揭示內生菌群落結構的多態性，以期掌握水稻內生菌資源情況及了解內生菌群落結構與水稻生長時期的關系，為深入探討內生菌與水稻間的相互作用機制和發掘植物益生內生菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為明恢63（MH63），種子由中國農業科學院植物保護研究所提供。于2013年12月24日播種，常規水育秧，3葉期移栽。試驗田位于海南省三亞市南繁科學技術研究院內，土壤質地為沙性土，中等肥力，前作水稻。水稻生長期間按常規進行水肥和病蟲害管理。于2014年1月、2月、3月、4月中下旬分別采集水稻幼苗期、分蘗期、開花期和結實期的水稻植株。

1.2 方法

1.2.1 采樣方法 使用對角線五點采樣法采集樣品，每點采樣3株，每小區采15株，將水稻連根帶土挖出，并在48 h內將樣品處理完畢。

1.2.2 水稻莖組織內生菌分離 采用表面消毒研磨法分離水稻內生菌[13]。（1）稱取水稻莖部組織5 g，置于20%的次氯酸鈉溶液（加入2滴吐溫20）中浸泡10 min，再用無菌水漂洗3次，并將最后一次漂洗過的無菌水涂布平板進行細菌培養，若無細菌生長則證明植物材料表面已消毒完全；（2）將漂洗好的樣品移入無菌研缽中，用滅菌的剪刀將材料剪碎，加入20 mL無菌水，充分研磨10 min，再分別取200 μL研磨液和10倍稀釋溶液涂平板；（3）將平板置于28 ℃培養箱中培養48 h，挑取單菌落，進行劃線純化培養，再從劃線培養的平板上挑取單菌落于液體培養基中進行培養，振蕩搖床的培養溫度為28 ℃，轉速為150 r/min，培養28～36 h，將菌液分裝備份，部分菌體用于DNA提取，部分菌體用于低溫保存。

1.2.3 內生菌培養基 YMA培養基：甘露醇10 g，K2HPO4 0.25 g，MgSO47H2O 0.2 g，NaCl 0.1g，CaCO3 0.1g，酵母粉3.0 g，瓊脂15 g，加水至1 L，pH7.0～7.2；BPA肉汁胨培養基：牛肉膏 3 g，蛋白胨5 g，酵母粉1 g，蔗糖10 g，加水至1 L，pH 7.0～7.2。

1.2.4 菌種的保存 吸取0.5 mL菌液及等體積40%的甘油于離心管中，制成20%的菌種，于-80 ℃保存。

1.2.5 DNA提取 將供試菌株活化后接種到液體培養基中，于28 ℃振蕩培養48 h，待菌體生長至對數中后期，離心收集菌體于2 mL離心管中。采用硅藻土-堿性裂解提取法[14]提取內生細菌DNA。

1.2.6 16S rDNA擴增 以提取的內生菌DNA為模板擴增細菌16S rDNA，正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′），反向引物1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[15]。50 μL PCR反應體系：DNA模板（10 ng/μL）1μL，引物（10 pmol/μL）各1 μL，2×Go Taq Green Master Mix（Promega）25 μL，ddH2O 22 μL。PCR擴增程序：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，57 ℃復性30 s，72 ℃延伸1.4 min， 共35個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.3 數據處理

1.3.1 水稻內生菌的鑒定 將測序得到的結果拼接后，分別登陸NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和Ezbiocloud（http：//www.ezbiocloud.net/）進行序列比對，確定其與已知序列的同源關系，序列相似性達到98%以上的歸為同一個種。

1.3.2 內生細菌多樣性指數計算[16] Shannon-Wiener多樣性指數（H′）、Simpson優勢度指數（D）計算公式如下：

H′=-Σ[Ni/Nln（Ni/N）]

式中：Ni為第i個種的個體數目，N為群落中所有種的個體總數。群落中生物種類越多代表群落的復雜程度增高，即H′值愈大，多樣性越高，群落所含的信息量愈豐富。

D=1-ΣPi2

其中：Pi=Ni/N。D值越大，表示優勢物種越少，亦表示奇異度越高。

2 結果與分析

2.1 水稻可培養內生細菌的分離與鑒定結果

通過平板培養的方法從不同時期水稻莖內共分離到內生細菌529株，以27F、1492R為引物進行16SrDNA片段擴增，得到長度約1 400 bp的擴增片段。將測序所得到的序列拼接后在Ezbiocloud中進行比對，相似度大于98%以上的歸為同一個種。結果表明（表1），水稻品種明恢63莖部內生菌涉及細菌域的4個門、6個綱、51個屬，共99個種。包括變形菌門（Proteobacteria）α-變形菌綱（Alphapro

teobacteria）的14個屬、 β-變形菌綱（Betaproteobacteria）的10個屬、 γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）的9個屬、 厚壁菌門（Firmicutes）桿菌綱（Bacilli）的7個屬、 擬桿菌門（Bacteroidetes）擬桿菌綱（Bacteroidetes）的4個屬以及放線菌門（Actinobacteria）放線菌綱（Actinobacteria）的7個屬， 主要包括伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）的8個不同種； 其次，芽孢桿菌屬（Bacillus）和根瘤菌屬（Rhizobium）各含有6個不同種；無色菌屬（Achromobacter）和新鞘氨醇桿菌屬（Novosphingobium）各含有5個不同種。

2.2 水稻莖部內生細菌在各個時期的生長情況

水稻莖組織內生細菌在不同時期的生長情況統計結果見表2。水稻幼苗期、分蘗期、開花期、結實期分離到的莖組織內生細菌分別為23個屬33個種、30個屬44個種、15個屬20個種、20個屬29個種。其中分蘗期水稻莖部內生細菌種類最多，開花期內生細菌種類最少，且不含厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）。分離所得的水稻莖部內生細菌中，Burkholderia gladioli在幼苗期和開花期豐富度均最高，分別占17.35%和20%；Burkholderia vietnamiensis在分蘗期豐富度最高，占11.96%；Burkholderia seminalis在結實期豐富度最高，占16.67%。

在水稻的4個生長時期中，伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）、草螺菌屬（Herbaspirillum）和黃桿菌屬（Flavobacterium）均有發現。在水稻幼苗期、分蘗期和開花期，伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia）為主要優勢菌，相對豐度分別為17.34%，13.04%，40.00%；在水稻結實期，優勢菌為芽孢桿菌（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），相對豐度分別為20.99%和20.37%。

水稻4個時期均含有特異的內生細菌種類。Kaistia、Devosia、Roseateles、Dyadobacter、Stenotro-

phomonas僅分離于水稻幼苗期；Ensifer、Ancylobacter、Cupriavidus、Ideonella、Pelomonas、Enterobacter、Cohnella、Novosphingobium、Promicromonospora、Met-

hylobacterium、Leucobacter僅分離于水稻分蘗期；Xenophilus、Dyella、Kosakonia僅分離于水稻開花期；Labrys、Shinella、Acidovorax、Paenibacillus、Rummeliibacillus、Pseudoxanthomonas、Xanthomonas、Sphingobacterium僅分離于水稻結實期。

2.3 不同生長時期水稻莖部內生細菌多樣性分析

植物內生菌的生物多樣性是衡量其內環境是否穩定和健康的一個重要指標，適宜的植物內環境，其內生細菌多樣性豐富，優勢度低，細菌種類分布均勻。通過計算得到水稻4個時期莖組織內生細菌的多樣性指數和優勢度指數。結果表明（圖1），4個時期水稻莖部內生細菌的Shannon-Wienner多樣性指數和 Simpson優勢度指數為：幼苗期（3.13，0.053）、分蘗期（3.49，0.035）、開花期（2.62，0.087）、結實期（2.80，0.081）。Shannon-Wienner多樣性指數排序：分蘗期>幼苗期>結實期>開花期；Simpson優勢度指數排序：開花期>結實期>幼苗期>分蘗期。水稻莖部內生細菌具有較豐富的遺傳多樣性，不同生長期莖組織內生細菌種群多樣性、優勢度存在差異。分蘗期水稻莖部內生細菌優勢度較低，但種群種類較豐富，且分布均勻；開花期水稻莖部內生細菌優勢菌群集中，優勢屬突出，存在單一物種Burkholderia gladioli（相對豐度高達20%），造成開花期水稻莖組織內生細菌優勢度最大。

3 討論與結論

為了得到能夠用于純培養并能進一步研究、應用的植物內生細菌，本研究采用傳統的分離培養方法對水稻4個不同生長期莖組織內生細菌進行分離、純化及鑒定。目前報道的水稻內生細菌種類33個屬64個種，主要包括Bacillus、Enterobacteriaceae、

Methylobacterium、Pantoea、Pseudomonas及其相近屬。本研究分離出了種類更加豐富的水稻內生細菌。其中，水稻幼苗期、分蘗期、開花期優勢菌為伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），且種數和豐富度均最高；而結實期優勢菌為芽孢桿菌（Bacillus）和伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia），這與劉云霞等[17]和胡桂萍等[10]報道的從水稻中分離到的內生細菌優勢菌為芽孢桿菌屬的結果相同。

本研究發現，在水稻的4個生長時期，水稻莖部中都存在黃桿菌（Flavobacterium）、草螺菌（Herbaspirillum）和伯克霍爾德氏菌（Burkholderia），它們在水稻與環境的互作過程中可能發揮著重要的作用。王銀善等[18]從農藥污染嚴重的棉田土中分離到一株對硫磷降解能力較強的黃桿菌P3-2，該菌還可降解殺螟松、甲基對硫磷和水胺硫磷等有機磷農藥。王以斌等[19]發現，黃桿菌能夠產生紅色抑藻活性物質（靈菌紅素），可有效抑制塔瑪亞歷山大藻細胞的生長。草螺菌作為植物體內的微需氧固氮菌，是一類嗜用有機酸、耐性強、可在高糖培養基上生長并固氮的微生物。伯克霍爾德氏菌是一類能夠利用自身固氮的微生物，在水稻4個生育期中最有優勢。李紀順等[20]研究發現，在小麥上分離得到的一株伯克霍爾德氏菌具有固氮和解磷活性，能促進小麥根的生長，且對小麥紋枯病、小麥全蝕病和番茄南方根結線蟲病等都具有良好防治效果。

植物不同生長時期的內環境有所不同，會影響植物內生菌群落結構及其多樣性的變化。水稻莖組織內生細菌種類豐富度在宿主植物中的變化規律是：從幼苗期到分蘗期上升，開花期下降，結實期豐富度又有所上升。黎起秦等[12]研究發現，廣西水稻內生菌數量從苗期到分蘗期上升，于孕穗期達到最高，從灌漿期到乳熟期數量下降。這與本研究結果（開花期水稻莖部內生菌豐富度相對較低，結實期水稻莖部內生細菌又有所增加）不太一致，這可能是由于植物內生菌主要來自土壤、空氣、種子，與植物品種、栽培環境、氣候條件等有著直接的關系。

本研究得到的內生細菌中有大量的有益微生物，可用于開發生物肥料，或作為生物防治菌和環境污染修復菌。這些益生菌如何有效應用于農業生產中仍有待深入研究。同時，在今后的研究中，還需進一步揭示這些內生細菌對宿主稻株的影響和作用，以及內生菌群落的變化與水稻生長之間的關系等。這些問題的明確對今后水稻栽培和生物防治具有積極的意義。

參考文獻

[1] Bulgarelli D， Schlaeppi K， Spaepen S， et al. Structrue and functions of the bacterial microbiota of plants[J]. Annual Review of Plant Biology， 2013， 64： 807-838.

[2] 姜曉宇， 高菊生， 徐鳳花， 等. 水稻種子內生細菌多樣性及其分泌植物生長素能力的測定[J]. 微生物學報， 2013， 53（3）： 269-275.

[3] Xiong X Q， Liao H D， Ma J S， et al. Isolation of a rice endophytic bacterium， Pantoea sp. Sd-1， with ligninolytic activity and characterization of its rice straw degradation ability[J]. Letters in Applied Microbiology， 2014， 58： 123-129.

[4] 馬 瑩， 駱永明， 滕 應， 等. 內生細菌強化重金屬污染土壤植物修復研究進展[J]. 土壤學報， 2013， 50（1）： 195-202.

[5] Sun K， Liu J， Jin L， et al. Utilizing pyrene-degrading endophytic bacteria to reduce the risk of plant pyrene contamination[J]. Plant and Soil， 2014， 374（1-2）： 251-262.

[6] Gayathri P， Muralikrishnan V. Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from mangrove plant for antimicrobial activity[J]. International Journal of Microbiology and Applied Sciences， 2013， 2（11）： 78-89.

[7] 彭 雙， 楊 茹， 閆淑珍， 等. 殺線蟲植物內生細菌和根際放線菌對根結線蟲的防效[J]. 植物保護學報， 2012， 39（1）： 63-69.

[8] Hill W A， Bacon-Hill P， Crossman S M， et al. Characterization of N2-fixing bacteria associated with sweet potato roots[J]. Canadian Journal of Microbiology， 1983， 29（8）： 860-862.

[9] Rasouli-Sadaghiani M H， Malakouti M J， Khavazi K， et al. Siderophore efficacy of Fluorescent pseudomonades affecting labeled iron（59Fe） uptake by wheat（Triticumaestivum L.）genotypes differing in Fe efficiency[M]//Use of Microbes for the Alleviation of Soil Stresses. Springer. New York： Springer， 2014： 121-132.

[10] 胡桂萍， 尤民生， 劉 波， 等. 水稻莖部內生細菌及根際細菌與水稻品種特性的相關性[J]. 熱帶作物學報， 2010， 31（6）： 1 026-1 030.

[11] Wang D， Yang S， Tang F， et al. Symbiosis specificity in the legume-rhizobial mutualism[J]. Cellular Microbiology， 2012， 14（3）： 334-342.

[12] 黎起秦， 焦 成， 農 倩， 等. 廣西水稻內生細菌的動態分布及其對水稻紋枯病菌的拮抗作用[J]. 中國生物防治， 2010， 26（3）： 321-319.

[13] Tiwari R， Kalra A， Darokar M P， et al. Endophytic bacteria from Ocimum sanctum and their yield enhancing capabilities[J]. Current Microbiology， 2010， 60： 167-171.

[14] Jia R Z， Tian C F， Man C X， et al. Screening of High effective alfalfa rhizobial strains with a comprehensive protocol[J]. Annals of Microbiology， 2008， 58（4）： 731-739.

[15] Chelius M， Triplett E. The diversity of archaea and bacteria in association with the roots of Zea mays L[J]. Microbial Ecology， 2001， 41（3）： 252-263.

[16] 馬煒梁. 高等植物及其多樣性[M]. 北京： 高等教育出版社， 1900： 276.

[17] 劉云霞， 張青文， 周明牂. 水稻體內細菌的動態研究[J]. 應用生態學報， 1999， 10（6）： 735-738.

[18]王銀善， 龐學軍. 黃桿菌P3-2的分離及降解有機磷農藥的某些性質[J]. 環境科學學報， 1985， 5（3）： 315-321.

[19] 王以斌， 何碧娟， 鄭 洲， 等. 紅樹林細菌Flavobacterium sp. 的抑藻活性物質鑒定及其對亞歷山大藻抑制作用的初步研究[J]. 中國海洋藥物雜志， 2008， 27（6）： 1-4.

[20] 李紀順， 陳 凱， 楊合同， 等. 伯克霍爾德氏菌B418的生物學特性[C]//中國植物病理學會2004年學術年會論文集， 2004： 432-437.