青天葵甲羥戊酸激酶基因的編碼蛋白預測和表達分析

黃瓊林　何瑞　詹若挺

摘 要 甲羥戊酸途徑（mevalonic acid， MVA）是植物三萜類化合物生物合成的主要途徑，而甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase， MVK）是MVA途徑中的關鍵限速酶之一。根據前期獲得的青天葵[Nervilia fordii（Hance）Schltr.]轉錄組數據，采用生物信息學方法對青天葵MVK基因編碼蛋白的理化特性、功能結構域、二級結構、信號肽、跨膜結構域等進行預測，并采用RPKM法分析該基因在青天葵球莖和葉片的表達量。結果表明，NfMVK基因編碼含有383個氨基酸的穩定型親水性、酸性蛋白質，與其他植物MVK蛋白同源性可達70%。NfMVK蛋白分子量為41.29 ku，含有甲羥戊酸激酶功能域，歸屬于GHMP_Kinase超級家族。該蛋白沒有任何信號肽、轉運肽和跨膜結構域，二級結構為混合型結構的蛋白質。NfMVK基因在青天葵中的表達趨勢為：球莖>葉片。該結果可為后續利用MVK基因調控青天葵三萜類活性成分的合成提供理論依據。

關鍵詞 青天葵；甲羥戊酸激酶；生物信息學；表達量

中圖分類號 R932 文獻標識碼 A

Abstract Mevalonic acid（MVA）pathway is the dominant approach to fulfill the triterpenoids synthesis in plants， and mevalonate kinase（MVK）is one of key rate-limiting enzymes in MVA pathway. In this paper， one MVK gene was identified from the transcriptome data of Nervilia fordii（Hance）Schltr. and named as NfMVK using bioinformatics. NfMVK encoded 383 amino acids and the coding protein was a stable hydrophilic and acid protein with a molecular weight at 41.29 ku. NfMVK protein， belonged to GHMP_Kinase superfamily， contained a mevalonate kinase functional domain and none signal peptide， and transmembrane region. Secondary structure prediction revealed NfMVK was a hybrid protein. The expression level of NfMVK gene in corm was higher than in leaf. The study would provide a firm foundation for regulating the synthesis of effective triterpenoids by utilization of MVK gene in N. fordii.

Key words Nervilia fordii（Hance）Schltr.； Mevalonate kinase； Bioinformatics； Expression

青天葵是嶺南地區名貴中藥，為蘭科植物毛唇芋蘭[Nervilia fordii（Hance） Schltr.]的干燥全草或葉片，具有清熱、潤肺、散瘀、解毒等顯著功效[1-2]。由于自身萌發的苛刻條件和人類的過度開采，青天葵資源已經面臨瀕危。植物化學研究結果表明，三萜類化合物是青天葵發揮抗腫瘤、抗炎等功效的物質基礎之一[3-6]。因此，在青天葵藥效成分比較清楚的前提下，利用現代植物生物工程提高三萜類化合物的含量，是提高青天葵藥效，緩解青天葵資源緊缺的新思路。

甲羥戊酸（mevalonic acid， MVA）途徑是三萜類成分生物合成的主要途徑[7]，以乙酰輔酶A為原料，經過MVA這一關鍵前體和一系列酶促反應，生成重要中間體異戊烯基焦磷酸酯（isopentenyl diphosphate，IPP）及其雙鍵異構體二甲丙烯二磷酸（dimethyallyl diphosphate， DMAPP）。IPP先與DMAPP結合生成牻牛兒基焦磷酸（geranyl diphosphate， GPP），再與GPP以頭尾方式連接合成法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate， FPP），最后FPP以尾尾方式連接形成三萜類化合物[8]。甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase， MVK）是MVA途徑酶促反應中第一個ATP依賴酶，能將三磷腺苷上的磷酸基團轉移到MVA的5位羥基上而產生甲羥戊酸-5-磷酸（mevalonate-5-phosphate， MVAP），這一過程還伴隨著ADP的釋放并最終生成IPP[9]。因此，MVK被認為是萜類生物合成MVA途徑的關鍵限速酶之一。MVK基因參與MVA途徑合成多種萜類及其衍生物，對植物萜類成分積累、生長發育具有重要的調控作用，目前已從杜仲[10]、三七[11]等藥用植物的轉錄組數據中鑒定獲得。本研究在前期青天葵轉錄組測序結果的基礎上，對青天葵MVK基因進行生物信息學和表達量分析，為探討MVK基因調控青天葵萜類成分的生物合成機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

前期研究[12]中，本課題組以生長旺盛期的成熟青天葵葉片和球莖為材料，利用Illumina RNA-seq高通量測序平臺進行全轉錄組測序，通過序列組裝、比對和注釋共獲得142 220條unigene。本研究以“mevalonate kinase”為搜索主題詞，以E<10為標準，在獲得注釋的青天葵轉錄組基因數據庫中檢索編碼青天葵甲羥戊酸激酶的Unigene序列。并在NCBI的Genbank數據庫下載海棗、丹參等10種植物MVK基因的編碼區序列。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 采用OMIGA軟件將MVK基因編碼區翻譯成氨基酸序列，利用在線軟件Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列，計算基因編碼蛋白的基本理化參數，并運用Protscale在線工具（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的親水性/疏水性特征；分別使用ClustalX1.86和MEGA 4.0軟件完成氨基酸序列的多重比對和系統進化樹的構建；采用NCBI的Conserved Domains Database（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測青天葵MVK蛋白具有的保守功能域；通過SOPMA在線工具（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=npsa_sopma.html）分析青天葵MVK蛋白的二級結構分析；分別采用TargetP1.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）和TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/ services/ TMHMM-2.0/）完成青天葵MVK蛋白的轉運肽、信號肽和跨膜結構域的預測。

1.2.2 青天葵MVK基因的表達量分析 采用RPKM法（Reads Per Kb per Million reads）計算青天葵MVK基因在葉片和球莖的表達量，其計算公式為：

RPKM（MVK）=

設RPKM（MVK）為編碼青天葵MVK基因的Unigene表達量，則C為唯一比對到編碼青天葵MVK基因的Unigene讀數，N為唯一比對到所有Unigene的總讀數，L為編碼青天葵MVK基因的Unigene的堿基數。

2 結果與分析

2.1 青天葵MVK基因檢索結果

在青天葵轉錄組基因數據庫里檢索到注釋為MVK基因的Unigene 16258，其長度為1 158 bp，包含MVK基因編碼區全長。因此，選擇Unigene 16258序列用于本研究分析，并命名為NfMVK。

2.2 MVK蛋白的基本理化特征分析

由表1可知，海棗等10種植物的MVK蛋白均含有380多個氨基酸，分子量在40～42 ku之間，說明不同植物來源的MVK蛋白在氨基酸個數和分子量上并無明顯的差異；理論等電點均小于7，表明這些MVK蛋白均屬于酸性蛋白質；不同植物MVK蛋白多肽鏈整體均顯示為親水性蛋白；不同來源的MVK蛋白的不穩定系數均小于40，屬于穩定類蛋白質。NfMVK編碼蛋白包含383個氨基酸，分子量為41.29 ku，也為穩定類親水性、酸性蛋白質，可見其與其他MVK蛋白具有相似的理化特征。

2.3 MVK蛋白序列多重比對和進化分析

利用ClustalX 1.83軟件對NfMVK基因編碼蛋白與其余10種MVK蛋白進行多重序列比對，結果見圖1。NfMVK編碼蛋白與其他MVK蛋白序列存在著多處保守區域，其中與海棗MVK蛋白的相似度最高，為70%，與黃芪MVK蛋白相似較低，也可達63%，說明NfMVK編碼蛋白與其他MVK蛋白有著較好的同源性，初步認為NfMVK為編碼青天葵MVK蛋白的基因。

從系統進化樹（圖2）也可看出，NfMVK編碼蛋白與同為單子葉植物來源的海棗、小果野蕉MVK蛋白首先聚成一支，而雙子葉植物來源的MVK蛋白則聚焦成另外一個分支，這與傳統植物進化結果相一致。

2.4 NfMVK編碼蛋白的保守功能域預測

分析蛋白質序列中含有的功能域，能夠推測蛋白質的功能。本研究采用CDD在線工具預測NfMVK編碼蛋白的保守功能域，結果顯示（圖3），NfMVK編碼蛋白包含GHMP_Kinase N端和C端功能域，分別位于130～211和293～365個氨基酸之間，說明其歸屬于包括高絲氨酸激酶、半乳糖激酶和甲羥戊酸激酶的GHMP_Kinase超級家族。除此之外，NfMVK編碼蛋白還含有位于7～344個氨基酸之間的Mevalonate Kinase多域功能區，表明其具有甲羥戊酸激酶的功能，因此，NfMVK確定為青天葵甲羥戊酸激酶基因，其編碼蛋白即青天葵甲羥戊酸激酶。將NfMVK核苷酸序列提交至Genbank，獲得的登記號為KP280082。

2.5 青天葵MVK蛋白的信號肽、轉運肽和跨膜結構分析

信號肽、轉運肽位于蛋白的N端，前者指導分泌性蛋白到內質膜上合成，后者引蛋白質在細胞質基質游離核糖體上合成的前體蛋白轉運至葉綠體基質中發揮作用。信號肽和轉運肽的分析有利于對蛋白質的細胞定位等特性的掌握[13]。采用TargetP1.1在線工具分析結果顯示，NfMVK蛋白均不含有信號肽和轉運肽。

跨膜結構是膜內蛋白和膜脂層相結合、在細胞膜上發揮“錨定”作用的主要部位，可見預測蛋白質的跨膜結構域有助于對蛋白質的結構和定位等信息的理解。利用TMHMM軟件預測NfMVK蛋白序列的跨膜結構域，結果如圖4所示，NfMVK蛋白不含跨膜結構域，整條多肽鏈均處于細胞膜外。因此，NfMVK是一種在細胞質基質中合成并直接發揮功能的蛋白質。

2.6 青天葵MVK蛋白的二級結構預測

如圖5所示，NfMVK蛋白二級結構由α-螺旋、不規則盤繞、β-轉角和延伸鏈等元件組成，各元件所占比例分別為43.86%、34.20%、5.48%和16.45%。從蛋白的整體結構來看，α-螺旋和不規則盤繞是NfMVK最大量的結構元件，而延伸鏈和β-轉角則相對分散于整條多肽鏈中。因此，NfMVK為混合型結構的蛋白質。

2.7 NfMVK基因的表達量分析

在對轉錄組高通量測序數據的處理中，RPKM法對測序長度和基因長度均作了歸一化，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達水平估計值具有可比性，是目前最常用的基因表達量計算方法[14]。結果見圖6所示，NfMVK在球莖中的RPKM表達量均高于在葉片中的RPKM表達量，提示青天葵甲羥戊酸激酶基因的表達趨勢為：球莖>葉片。

3 討論與結論

轉錄組分析已被公認為發現功能基因的有力手段。轉錄組以高通量模式挖掘功能基因，有助于整體、快速地解讀藥用植物的基因組信息，在分子水平為藥用植物的功能基因的發現、活性成分的生物合成及其調控機制的闡明提供重要的科學依據[15]。因此比起傳統的基因研究模式，經過簡并引物PCR、RACE技術等繁瑣步驟獲取藥用植物的功能基因，本研究通過轉錄組分析挖掘青天葵MVK基因具有明顯的優勢。

本研究應用生物信息學方法鑒定并分析了青天葵MVK的核苷酸和氨基酸序列，推測其為編碼383個氨基酸，以α-螺旋和不規則盤繞為主要結構元件的酸性、親水性穩定蛋白質，并與單子葉植物來源的MVK蛋白有著較高的同源性。青天葵MVK歸屬GHMP激酶超級家族中，含有甲羥戊酸激酶等3個保守功能域，表明其具有甲羥戊酸激酶的功能，如激酶活性、參與萜類代謝以及ATP結合細胞質定位等。TMHMM跨膜結構預測發現青天葵MVK蛋白不含跨膜結構域，說明其為細胞質酶，定位于細胞質中發揮催化作用。這些結論可為青天葵甲羥戊酸激酶的功能鑒定、表達載體構建、融合蛋白純化、基因工程調控等實驗研究提供理論指導。

甲羥戊酸途徑在藥用植物中可生成三萜皂苷合成所需的IPP等前體物質，因此MVK基因的表達情況可能會影響藥用植物中三萜類物質的含量。研究表明，MVK基因主要分布在根等地下器官[11，16-17]。本研究也發現，NfMVK在地下組織球莖中的表達高于地上組織葉片，與在其他植物中的表達趨勢相符合，推測青天葵三萜類成分主要在球莖中合成。

本研究利用生物信息學全面分析了NfMVK的分子功能，并初步明確其在青天葵中的表達趨勢，可為后續利用融合蛋白表達和植物侵染表達等研究驗證其生物學功能，為進一步應用NfMVK調控青天葵萜類成分合成奠定基礎。

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