升紅顆粒的提取純化工藝研究

李江等

【摘 要】 目的：優選升紅顆粒提取純化工藝的最佳條件。方法：處方中的雞血藤和花生紅衣用水提取，提取液濃縮后醇沉純化。設計正交試驗方法，以兒茶素、總黃酮含量為評價指標，對水提取工藝條件進行考察；以兒茶素、總黃酮轉移率和浸膏得率為指標對醇沉純化工藝條件進行考察。結果：水提取的最佳工藝條件為加水量為藥材量的12倍，每次提取時間為1.5h，共提取3次；醇沉純化的最佳工藝條件為濃縮液相對密度為1.10～1.15g/ml（30℃），含醇量為70%，靜置時間36h。 結論：優選出的最佳工藝條件經驗證其結果穩定，指標性成分含量高，可以用于投入生產。

【關鍵詞】 升紅顆粒；正交試驗設計；兒茶素；總黃酮

【中圖分類號】R284.2 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）07-0021-05

Abstract：Objectice To optimize the conditions of the extraction and purification technique for Shenghong granules. Methods Herb Caulis Spatholobi and peanut coat in formulation were extracted by water decocting，and the condensed extracted liquid was purified by ethanol precipitating. Taking the content of catechin and total flavonoids as evaluation markers for the extraction technique of water decocting，and the transferring rate of the catechin and total flavonoids，and extract yield as evaluation markers for the purification technique of ethanol precipitating，each technique condition was evaluated by orthogonal design. Results The optimum condition of water decocting process was that the crude herb powder were decocted for 3 times with 12-fold water，1.5 hour each time. The optimum condition of ethanol precipitating process was that extracted liquid was precipitated 36 hours，which relative density was 1.10～1.15g/ml（30℃）and concentration of ethanol was 70% . Conlusions The repeated experimental results are stable on the optimum conditions， and the contents of components for markers are high. which could be used for enlarged production.

Keywords：Shenghong granule； orthogonal design； catechin； total flavonoids

升紅顆粒是根據我院腫瘤科臨床驗方開發的純中藥復方制劑，由雞血藤、花生紅衣、大棗、枸杞子等藥材組成，用于治療腫瘤患者化療誘導的血小板減少癥。研究證實，雞血藤和花生紅衣均含有具有刺激造血祖細胞增殖作用的兒茶素類成分[1-2]，而雞血藤中的黃酮類成分也具有促進血虛動物模型造血功能的作用[3]。因此，在研究制劑工藝時以兒茶素含量和總黃酮含量作為考察提取純工藝的指標。考慮到原方以水煎入藥，且兒茶素和黃酮類成分在水、醇中的溶解性均較好，因此采用了傳統的水提醇沉工藝路線，設計正交試驗方法，對水煎煮提取和醇沉純化兩步驟的影響因素進行考察，對工藝條件進行優選，為升紅顆粒制劑工藝的制定提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀；Libra S32 紫外分光光度計（英國 Biochrom）；RE-52AA旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-Ⅲ循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；FA2004電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 兒茶素對照品（批號：110877-201203，中國食品藥品檢定研究院）；蘆丁對照品（批號：100080-200707，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；雞血藤（批號：140201，安徽井泉集團中藥飲片有限公司）；花生紅衣（批號：20130112，豪州成源中藥飲片有限公司）。

2 方法與結果

2.1 高效液相色譜法測定兒茶素的含量[4]

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent HC-C18（4.6×250mm，5μm）；流動相為水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；檢測波長280nm；流速0.8ml/min；柱溫35℃。此條件下兒茶素色譜峰的保留時間為20.03min，理論塔板數為4169，分離度為19.03，拖尾因子為0.99。

2.1.2 標準曲線的制備 精密稱定兒茶素對照品約10.0mg，置10ml容量瓶中，甲醇定容，配制成含量為0.98172mg/ml的對照品溶液。精密量取對照品溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0ml分別置于10ml容量瓶中，甲醇定容，20μl進樣測定，以進樣量（X，μg）對色譜峰面積（Y）進行線性回歸，回歸方程為：Y=666049X-23116，相關系數r=0.9999，線性范圍為0.098172～3.92688μg。

2.1.3 樣品中兒茶素的含量測定 按正交試驗設計各次實驗規定的條件制備樣品，精密量取規定體積的樣品液，置蒸發皿中水浴蒸干，用流動相溶解，過濾后定容于25ml容量瓶，過0.45μm微孔濾膜后進樣20μl測定峰面積，代入回歸方程計算兒茶素的進樣量，換算成雞血藤和花生紅衣藥材總量中兒茶素的含量。

2.2 絡合-分光光度法測定總黃酮含量[5-6]

2.2.1 標準曲線的制備 精密稱定蘆丁對照品約10mg，用50%的乙醇定容于50ml容量瓶，制成對照品溶液（0.1830mg/ml）。精密量取對照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml分別置于25ml容量瓶中，各加50%乙醇使成5ml，再各加5%亞硝酸鈉溶液1.0ml，搖勻，放置6min，各加10%硝酸鋁溶液2.0ml，搖勻，放置6min；再各加4.3%氫氧化鈉試液10ml，分別用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min，制成待測對照品溶液。以第一瓶為空白對照，在510nm處測定各濃度對照品溶液吸光度，以吸光度（A）對濃度（C，mg/ml）進行線性回歸，得回歸方程C=0.0811A-0.0012（r=0.9995），線性范圍為0.0183-0.0915mg/ml。

2.2.2 樣品中總黃酮的含量測定 按正交實驗設計各次實驗規定的條件制備樣品，精密吸取規定體積的樣品液，置蒸發皿中水浴蒸干，用50%的乙醇溶解，過濾定容于100ml容量瓶中，精密量取0.0、1.0ml，分別置25ml容量瓶中，按照“2.2.1項”下的方法操作，過濾，取續濾液在510nm處測定吸光度，代入回歸方程計算總黃酮的含量，換算成雞血藤和花生紅衣藥材總量中總黃酮的含量。

2.3 浸膏得率的測定 精密量取25ml樣品溶液，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，105℃干燥至恒重，置于干燥器中冷卻30min，迅速稱重，換算成雞血藤和花生紅衣藥材總量中浸膏得率。

2.4 工藝條件篩選的正交實驗設計

2.4.1 水煎煮提取工藝 以加水量（A，以藥材量的倍數計算）、煎煮時間（B，以沸騰時開始計時）、煎煮次數（C）作為試驗因素，每個因素備選了3個水平，詳見表 1。

利用L9（34）正交表安排實驗，按2倍處方量稱取雞血藤、花生紅衣藥材粗粉適量，按各次實驗因素水平的要求進行水煎煮提取，過濾后合并，定容于1000ml容量瓶，精密量取樣品液20ml，置蒸發皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”項下方法測定兒茶素和總黃酮含量。

2.4.2 醇沉工藝 水煎煮提取液中含有糖類、氨基酸、鞣質等水溶性雜質，造成收膏率高，影響后續的制劑成型和日服量，故考慮醇沉除雜。以濃縮液相對密度（D）、含醇量（E）、靜置時間（F）作為實驗因素，每個因素備選3個水平，條件見表2。

利用L9（34）正交表安排實驗，按6倍處方量稱取雞血藤、花生紅衣藥材粗粉適量，以最佳水煎煮提取工藝提取后，過濾，合并濾液，濃縮成規定相對密度（30℃）的稠膏，精密稱定重量。然后將稠膏分成四份，精密稱定重量，其中一份用水稀釋定容于100ml容量瓶，用于測定該次最佳水煎煮提取實驗兒茶素和總黃酮的含量；另外三份精密測定體積，然后加乙醇至規定的含醇量，靜置規定的時間，過濾，定容于100ml容量瓶，用于測定醇沉后的兒茶素、總黃酮含量和浸膏得率。兒茶素和總黃酮含量的測定：精密量取樣品液5ml，置蒸發皿中水浴蒸干，按照“2.1.3”和“2.2.2”項下方法測定。根據醇沉前后兒茶素、總黃酮含量的變化，計算醇沉后兒茶素、總黃酮的轉移率。

醇沉后兒茶素轉移率=醇沉后兒茶素的含量/該次水煎煮提取實驗兒茶素含量×100%

醇沉后總黃酮轉移率=醇沉后總黃酮的含量/該次水煎煮提取實驗總黃酮含量×100%

2.5 實驗結果及分析

2.5.1 水煎煮提取各次正交實驗結果及方差分析 見表3、表4。

由表3可知，水煎煮提取實驗各因素對兒茶素提取率的影響大小為C>B>A，最佳工藝條件為A1B3C3；對總黃酮提取率的影響大小為C>A>B，最佳工藝條件為A3B1C3。表4方差分析的結果表明，A、B兩個因素對兒茶素、總黃酮提取率的影響無統計學意義，而C因素對兒茶素、總黃酮提取率的影響有統計學意義。由于水煎煮提取的目標主要是具有刺激造血祖細胞增殖作用的兒茶素，故以兒茶素含量權重為60%，總黃酮含量權重為40%進行加權綜合評分，由綜合評分的極差分析可知，各因素對綜合評分的影響大小為C>B>A，最佳工藝條件為A3B3C3；方差分析表明A、B兩因素對綜合評分的影響無統計學意義，而C因素對綜合評分的影響有統計學意義。因此選擇水煎煮提取的最佳工藝條件為A3B3C3，即加水量為12倍，煎煮時間為1.5h，煎煮次數為3次。

按照最佳水煎煮提取工藝條件進行3次驗證性實驗，兒茶素平均含量為1.0204mg/g，總黃酮平均含量為77.9289mg/g，證明該工藝條件是穩定、可行的。

2.5.2 醇沉各次正交實驗結果及方差分析 見表5、表6。

由表5可知，醇沉實驗各因素對兒茶素轉移率的影響大小為A>B>C，最佳工藝條件為A2B3C2；對總黃酮轉移率的影響大小為B>C>A，最佳工藝條件為A2B3C3；對浸膏得率的影響大小為A>C>B，最佳工藝條件為A3B1C1。表6方差分析的結果表明，A、B、C三個因素對兒茶素的轉移率的影響有統計學意義，而對總黃酮轉移率、浸膏得率的影響沒有統計學意義。由于醇沉的目標主要是在保留兒茶素、黃酮等有效成分的基礎上除雜，故以兒茶素轉移率權重為50%，總黃酮轉移率權重為30%，浸膏得率權重為20%進行加權綜合評分（由于浸膏得率與醇沉純化效果成反比關系，故以浸膏得率倒數進行評分），由綜合評分的極差分析可知，各因素對綜合評分的影響大小為B>A>C，最佳工藝條件為A2B3C3；方差分析表明A、B、C三個因素對綜合評分的影響均有統計學意義。因此選擇醇沉的最佳工藝條件為A2B3C3，即濃縮液相對密度為1.10～1.15g/ml，含醇量為70%，靜置時間為36h。按照最佳醇沉工藝條件進行3次驗證性實驗，兒茶素轉移率平均為78.54%，總黃酮轉移率平均為87.89%，浸膏得率平均為0.1471g/g，證明該工藝條件是穩定、可行的。

3 討論

進行醇沉工藝研究時，將最佳水煎煮提取后的樣品濃縮到規定的相對密度后進行醇沉，因此醇沉后的兒茶素、總黃酮的含量與醇沉前樣品中的兒茶素、總黃酮含量直接相關。由于各次最佳水煎煮提取的樣品中兒茶素、總黃酮的含量并不相同，最佳水煎煮提取的樣品中兒茶素、總黃酮的含量偏高者，醇沉后兒茶素、總黃酮含量也會相應偏高，如果直接以醇沉后兒茶素、總黃酮的含量作為醇沉工藝條件的考查指標，可能帶來較大的誤差。因此，對最佳水煎煮提取的樣品抽樣測定其兒茶素、總黃酮的含量，再對醇沉后的樣品測定兒茶素、總黃酮含量，根據醇沉前后兒茶素、總黃酮含量的變化，計算醇沉后兒茶素、總黃酮的轉移率，作為考查醇沉工藝條件的指標，可以避免各次最佳水煎煮提取樣品中兒茶素、總黃酮的含量不一致而帶來的誤差。

采用絡合-分光光度法測定各次正交實驗樣品中總黃酮含量，其實驗原理是黃酮類物質在堿性與亞硝酸根存在的環境下與鋁離子形成穩定的紅色絡合物，但我們在制備供試品過程中發現有紅色沉淀產生，造成測定結果不穩定。該現象與樣品中原花色素類物質在堿性條件下形成沉淀，并與鋁離子形成絡合物有關[7]，因此根據文獻采取了增加硝酸鋁試液劑量，并過濾除去沉淀的辦法，較好地解決了該問題。

參考文獻

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（收稿日期：2015.01.12）