昆侖雪菊中總黃酮的提取及其對腫瘤細(xì)胞活性研究

劉苑星

摘要：采用乙醇回流提取法提取昆侖雪菊中的總黃酮物質(zhì)，選取大孔樹脂分離純化昆侖雪菊中的總黃酮，用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測總黃酮含量，回歸方程為A=15.508C-0.0044，R2=0.9995。乙醇回流提取液中總黃酮含量為9.04%。通過MTT法測定黃酮對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，記錄統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)，抑制率=1-（實驗組A值一空白組A值）/（對照NA值一空白組A值）。抑制率≥30%判定藥物敏感試驗為陽性，抑制率≤30%判定藥物敏感試驗為陰性。

關(guān)鍵詞：昆侖雪菊；總黃酮；腫瘤細(xì)胞；抑制率

前言

昆侖雪菊為新疆特有植物，學(xué)名雙色金雞菊，屬菊科金雞菊一年生草本植物，是具有降血壓、降血脂等獨特功效的稀有高寒植物，具有極高的藥用價值。昆侖雪菊中的總黃酮含量高達(dá)12%，遠(yuǎn)超其他菊類。其富含的總黃酮具有多方面功效。其中，黃酮作為一種較強(qiáng)的抗氧化劑，其抗氧化能力是維生素E的10倍以上，可有效增強(qiáng)生物對病原體的抵抗能力，清除體內(nèi)的氧自由基，從而起到阻止細(xì)胞衰老、癌變的作用。因此昆侖雪菊中富含的總黃酮具有免疫調(diào)節(jié)的功能，是調(diào)節(jié)血糖、降低血壓血脂、抗衰老及癌變等有關(guān)藥物中重要的物質(zhì)。

目前，對于昆侖雪菊的植物分類學(xué)生物生態(tài)學(xué)特性等方面，國內(nèi)外的研究開發(fā)報道較多，除此之外對其研究甚少，尤其是藥理學(xué)方面，僅見其降血壓、降血脂、抗氧化、微循環(huán)及抗凝血作用的研究。有關(guān)昆侖雪菊對腫瘤細(xì)胞影響的研究，目前鮮見報道。為進(jìn)一步探討昆侖雪菊中黃酮物質(zhì)的抗腫瘤活性研究，首先從昆侖雪菊中提取總黃酮，進(jìn)一步研究昆侖雪菊中總黃酮對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用，不僅為開發(fā)和綜合利用昆侖雪菊資源提供一定的理論依據(jù)，更為中藥治療腫瘤疾病的新藥奠定理論與實踐基礎(chǔ)。

1藥物與儀器

昆侖雪菊（2015年10月采自新疆和田地區(qū)昆侖山區(qū)），紫外可見分光光度計，電子天平，電熱恒溫水浴鍋，水循環(huán)真空泵，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，亞硝酸鈉，硝酸鋁，乙醇，氫氧化鈉等均為AR級。

2實驗方法

2.1分離提取昆侖雪菊中的黃酮

乙醇回流提取液：用適量體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇浸泡昆侖雪菊粉末48h，將抽濾所得液體在溫度45℃條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)4h，提取液轉(zhuǎn)移到250ml容量瓶中，并定容到刻度，再取10ml溶液置50ml容量瓶中定容至刻度液。

2.2昆侖雪菊提取液的純化

取15g大孔樹脂，用95%乙醇浸泡24h。取10g大孔樹脂裝柱，用95%乙醇沖洗，沖洗至沖洗液與蒸餾水以1：4混合不顯白色渾濁為止。將沖洗好的大孔樹脂倒入昆侖雪菊粗提物中，搖床震蕩24h。將震蕩好的粗提物進(jìn)行抽濾，上層固體用95%乙醇浸泡24h，下層液體密封冷藏備用。次日將浸泡好的固體進(jìn)行抽濾，抽濾所得下層液體在45℃條件下旋蒸1.5h，所得粘稠液體經(jīng)稱量為9.13g，冷藏備用。測得總黃酮含量為68.04%。

2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

（一）對照品溶液的制備

精密稱取在120℃減壓干燥至恒重的蘆丁對照品50mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇35mL，置水浴上微熱使其溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密吸取5mL，置于50mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得（每1mL中含有無水蘆丁0.1mg）。

（二）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別按照0.0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml濃度梯度量取對照品溶液（0.1mg/ml），并置于10ml容量瓶，各加30%乙醇使成5.0ml，各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3ml，充分搖勻，放置8分鐘。各精密加入10%硝酸鋁溶液0.3ml，充分搖勻，放置8分鐘。各加lmol/L氫氧化鈉溶液4.0ml，用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻，放置16分鐘，用分光光度計，在510nm波長處測定其吸光度。分別以濃度、吸光度為橫、縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

2.4提取液中總黃酮含量的測定

量取不同提取液100ml置于25ml容量瓶，加水至6ml，以相應(yīng)溶液為空白對照組，根據(jù)以上方法配制樣品溶液，在510nm波長處測定A值。代入回歸方程后得出結(jié)果，見表1。

2.5 MTT法測定黃酮對腫瘤細(xì)胞活性的影響

采用MTT法檢測樣品對MCF7細(xì)胞增殖的抑制作用。將MCF7細(xì)胞分別以3x104個/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，加入培養(yǎng)液，在37℃飽和濕度、5%C02條件下孵育24h，24h后觀察細(xì)胞貼壁的情況。取出每孔的培養(yǎng)液，按照梯度濃度0、25、50、100、200、400、600μg/ml向每組各孔中加入昆侖雪菊提取液的培養(yǎng)溶液，同時向?qū)φ战M加入相同濃度得DMSO，陽性對照組每組為4個孔，向每孔加入順鉑（20g/μl），在37℃飽和濕度、5%C02條件下孵育48、72、96h，在培養(yǎng)結(jié)束4h前，向每孔加入5mg/mlMTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔中的上清液，向每孔加入DMS0150μl，置于搖床上低速振蕩，在結(jié)晶物充分溶解后，用DNM-9602G型酶聯(lián)免疫檢測儀（OD510nm）測每孔的吸光度值，由公式可得細(xì)胞增值抑制率，抑制率=1-（實驗組A值一空白組A值）/（對照組A值一空白組A值），抑制率≥30%判定藥物敏感試驗為陽性，抑制率≤30%判定藥物敏感試驗為陰性。

3結(jié)果與分析

按照濃度梯度0、25、50、100、200、400、600μg/ml，將不同濃度的昆侖雪菊提取液作用于MCF7細(xì)胞，孵育72h后，觀察不同濃度的昆侖雪菊提取液樣品對MCF7細(xì)胞增殖的影響，并記錄數(shù)據(jù)。由表2知，昆侖雪菊總黃酮粗提物對MCF7細(xì)胞有抑制作用，其IC50為372.59μg/ml，增大濃度，細(xì)胞增殖的抑制率也隨之增大，因此昆侖雪菊總黃酮粗提物對MCF7細(xì)胞生長抑制影響呈劑量依賴性。通過與提取物的IC50比較，昆侖雪菊總黃酮的純化物對MCF7細(xì)胞增值具有抑制作用。

4結(jié)論與討論

由于目前主流的治療癌癥方法的缺陷很大，因此國內(nèi)外科學(xué)家們開始將研究抗腫瘤藥物的目光移至天然產(chǎn)物上，其中包括從中草藥中提取抗腫瘤活性強(qiáng)的物質(zhì)。本研究中，用乙醇回流提取法提取昆侖雪菊黃酮類化合物。利用可見紫外分光光度法對昆侖雪菊藥材中總黃酮的含量進(jìn)行測定。選用蘆丁為對照品，選擇測定波長510nm，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程，再通過樣品吸收度值計算含量結(jié)果發(fā)現(xiàn)，昆雪菊總黃酮在濃度為0.01～0.08mg/mmL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

該研究采用MTT法檢測昆侖雪菊總黃酮粗提取物對細(xì)胞增殖的影響。由最終結(jié)果可得，昆侖雪菊總黃酮粗提物對MCF7細(xì)胞增值具有抑制作用?；罴?xì)胞比例隨樣品濃度加大逐漸減少，細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯上升。綜上，昆侖雪菊總黃酮純化物對MCF7細(xì)胞有很好的抑制作用，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞有關(guān)。

本課題研究昆侖雪菊中總黃酮對腫瘤細(xì)胞活性抑制作用，在以后的研究中，還應(yīng)就具體增值抑制作用機(jī)理展開具體研究。