促血管生成素—2在腎細胞癌中的表達及其意義

楊文杰　劉尚瑩　陳強　王杰

【摘要】 目的：研究促血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）在腎細胞癌中的表達及其意義。方法：用免疫組化SP法檢測50例腎細胞癌組織、配對癌旁組織以及6例正常腎組織中的Ang-2，并結合臨床資料進行具體分析。結果：Ang-2在腎細胞癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的陽性表達率分別為62.0%（31/50）、28.0%（14/50）和0（0/6），三者比較差異有統計學意義（P<0.05）。Ang-2在Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期的陽性表達率分別為51.4%（19/37）和92.3%（12/13）；Ang-2在術前有血尿組和無血尿組的陽性表達率分別為85.7%（12/14）和52.8%（19/36），兩者比較差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：Ang-2在腎細胞癌組織表達明顯高于非癌組織，表明其在腎細胞癌的發生發展中起重要作用，與腎細胞癌的分期、轉移有關。

【關鍵詞】 腎細胞癌； 促血管生成素-2； 免疫組化

【Abstract】 Objective：To study the expression and significance of Ang-2 in renal cell carcinoma. Method：The expression of Ang-2 was measured by immunohistochemistry in tissue sections from 6 cases of normal renal tissues， 50 cases of RCC and their pericarcinous tissues，their correlation with clinical data features were analyzed.Result：The positive rate for expression of Ang-2 in RCC， their pericarcinous and normal renal tissue were respectively 62.0%（31/50），28.0%（14/50） and 0（0/6），the expression of Ang-2 in RCC was significantly higher than those in pericarcinous tissue and normal renal tissue，the difference was statistically significant among them（P<0.05）.The positive expression rates of Ang-2 in the stages of Ⅰ-Ⅱ and Ⅲ-Ⅳ were respectively 51.4%（19/37） and 92.3%（12/13），the positive expression rates of Ang-2 in the stages of Ⅲ-Ⅳ was higher than those in the stages of Ⅰ-Ⅱ；the positive expression rates of Ang-2 in patients with and without hematuresis were respectively 85.7%（12/14） and 52.8%（19/36），the positive expression rates of Ang-2 in RCC with hematuresis was higher than those without hematuresis，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The expression of Ang-2 in the RCC is higher than those in the noncancerous renal tissue，which indicates that it may play an important role during the development of RCC.It has relationship to RCC angiogenesis， clinical stage and metastasis.

【Key words】 Renal cell carcinoma； Angiopoietin-2； Immunohistochemical stain

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.35.005

腎細胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，又稱腎腺癌，簡稱腎癌。在我國泌尿系統惡性腫瘤中發病率僅次于膀胱癌，約占成人惡性腫瘤的2%～3%[1]。RCC起源于腎實質泌尿小管上皮系統，是一類血管形成極為豐富的實性腫瘤，而新生血管形成在腫瘤的發生、發展及轉移過程中起關鍵作用。近年來研究發現，促血管生成素（Angiopoietin，Ang）在腫瘤血管調控中起著重要作用。促血管生成素是血管內皮細胞的特異性酪氨酸激酶受體Tie-2的天然配體，目前發現的構型有4種，其中Ang-2是腫瘤性血管新生起始的強化因素，與腫瘤血管的生成關系密切[2]。本研究探討Ang-2在腎細胞癌中的表達及其與患者性別、年齡、血尿及臨床分期的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取山西醫科大學第一醫院泌尿外科2013年1月-2014年12月間的50例腎癌手術切除標本，所有腎癌患者術前均未行放、化療及免疫治療，且均為單側、單發，術后病理結果證實為腎細胞癌。其中男28例，女22例；年齡34～78歲，中位年齡61歲；術前有血尿者為14例，無血尿者為36例；根據美國癌癥聯合委員會（AJCC）腎癌臨床分期標準分為：Ⅰ期20例，Ⅱ期17例，Ⅲ期9例，Ⅳ期4例。此外6例正常腎組織取自腎外傷及腎結石切除標本。

1.2 試劑 兔抗人Ang-2多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購自博士德公司，一抗以1∶100稀釋使用，步驟按說明書。DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。其他試劑取自山西醫科大學第一臨床醫學院病理教研室。

1.3 免疫組織化學染色方法 所有標本經甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片，經二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，H2O2阻斷內源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽微波高壓抗原修復，滴加一抗置于37 ℃溫箱孵育1 h，滴加二抗并于37 ℃溫箱孵育30 min，PBS液洗滌3次，DAB底物顯色，蘇木素復染核，梯度酒精脫水，樹脂膠封片，置于顯微鏡下觀察，使用PBS液代替一抗作陰性對照。

1.4 判定標準 本研究在光鏡下結合染色強度和陽性細胞百分比判斷Ang-2在腎細胞癌中的陽性表達率。以腫瘤細胞胞漿或細胞膜上出現棕褐色顆粒為Ang-2陽性表達，染色愈濃代表陽性表達愈強。選取背景清晰的視野，在100倍顯微鏡下觀察，按組織染色深淺分為：未染色記作0分；淺黃色記作1分；棕黃色記作2分；棕褐色記作3分。選取染色均勻的區域于400倍顯微鏡下觀察，記錄5個視野中陽性細胞的百分比，計算其平均值。按染色細胞的比例分為4分：0～25%記作0分；25%～50%記作1分；50%～75%記作2分；>75%記作3分。組織染色強度與染色細胞百分比級別之和3～6分為陽性，以上檢測采用盲法獨立檢測。

1.5 統計學處理 使用SPSS 15.0統計軟件進行分析，計數資料采用 字2檢驗，小樣本（n<40）比較采用Fishers精確概率法檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang-2在腎細胞癌組織、癌旁組織及正常腎組織中的表達 免疫組化學染色Ang-2主要表達于細胞胞漿或細胞膜上（圖1），棕褐色顆粒狀為陽性著色。50例RCC患者中Ang-2的陽性表達率為62.0%（31/50），癌旁組織中Ang-2的陽性表達率為28.0%（14/50），6例正常腎組織中Ang-2均無陽性表達。RCC中Ang-2陽性表達率明顯高于癌旁組織及正常組織，差異均有統計學意義（P<0.05）；Ang-2陽性表達率在癌旁組織與正常腎組織中比較差異無統計學意義（P>0.05），見表1。

2.2 Ang-2的表達與患者臨床病理因素的關系 在50例RCC患者中，男性組Ang-2陽性表達率為60.7%（17/28），女性組Ang-2陽性表達率為63.6%（14/22），兩組比較差異無統計學意義（ 字2=0.01，P>0.05）；60歲以下組Ang-2陽性表達率為70.8%（17/24），60歲以上組Ang-2陽性表達率為53.8%（14/26），兩組比較差異無統計學意義（ 字2=1.53，P>0.05）；術前有血尿組Ang-2陽性表達率為85.7%（12/14），術前無血尿組Ang-2陽性表達率為52.8%（19/36），兩組比較差異有統計學意義（ 字2=4.64，P<0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期組Ang-2陽性表達率為51.4%（19/37），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期組Ang-2陽性表達率為92.3%（12/13），兩組比較差異有統計學意義（ 字2=5.22，P<0.05）。

3 討論

腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移都離不開新生血管的生成，新生血管網給腫瘤提供充足的血液供應、清除代謝產物的同時，在腫瘤的侵襲和轉移過程中亦發揮著重要作用。研究發現，豐富的新生血管不僅使腫瘤細胞進入血液循環的機會增加，而且可以促進腫瘤細胞侵入鄰近的淋巴管，從而發生淋巴轉移，此外新生血管的基底膜容易滲漏，腫瘤細胞易穿透血管基底膜而發生遠處轉移[3]。辛華等[4]研究表明，腫瘤在缺乏新生血管的情況下，其發展、侵襲及轉移的可能性均較小。腫瘤誘發血管的聚集和生成與腫瘤細胞本身釋放的一類促血管生成因子密切相關。腫瘤新生血管的生成是一個多步驟、多因素的復雜過程，受多種血管生成因子及抑制因子的調控。促血管生成素（Angiopoietins，Ang）是新發現的一類具有受體促進劑及抑制劑的促進血管生成因子，主要由血管內皮細胞分泌產生，作用于Tie2受體，與其他血管生成促進因子共同發揮作用，其中Ang-1、Ang-2與腫瘤血管生成的關系最為密切，其分子結構相似，但生物學功能相反[5-6]。Ang-2基因位于8p23，編碼496個氨基酸，與Ang-1有近60%的同源性，與Tie2受體結合而發揮作用[7]。Ang-2通過競爭性抑制Ang-1與Tie2相互作用而參與到血管的重塑，破壞血管的穩定性。在成人正常組織中，Ang-2分布于子宮、胎盤和卵巢等組織中，可能與上述組織生理過程中的血管重建有關[8]。但在病理情況下，Ang-2可表達于炎癥、創傷以及腫瘤部位，參與上述部位的血管重建及組織修復過程，而在腫瘤組織中的表達，可能與腫瘤發生、發展、轉移和侵襲等密切相關[9]。

目前有關腫瘤生長的研究認為，在早期腫瘤細胞形成所需要的血供和機體正常組織血供為同一來源，相互競爭，但由于腫瘤細胞的特點為高代謝、快速生長，所以其競爭血供的能力遠強于機體正常組織，為阻止腫瘤細胞的生長，機體則分泌Ang-2使腫瘤占據的血管發生退化，起到自殺性防御的作用[10]。所以早期血管不隨腫瘤的發生發展而增生，而是發生退化，此時Ang-2高表達，而VEGF的表達無明顯變化[11]。后期由于腫瘤血管退化、血供減少，組織缺氧壞死，從而誘發VEGF的表達增加，同時Ang-2阻斷Ang-1的血管穩定性作用，使血管內皮對生長因子的敏感性增強，促進血管重建。所以后期腫瘤血管增生顯著，此時Ang-2及VEGF表達均明顯增多。在腫瘤的發生發展過程中原有成熟血管發生了退化，腫瘤新生血管開始生成。Ang-2的表達增加可認為是腫瘤血管新生的標志，意味著腫瘤細胞的快速增長并易發生轉移。

在人體正常組織中，Ang-2僅存在于女性生殖系統等部分血管重建部位，而其他正常成熟組織中呈無表達或輕微表達。病理情況下，Ang-2表達上調已在胃癌、食管癌及肝癌等多種腫瘤中得以證實。在細胞癌變過程的早期，Ang-2的表達增多，與腫瘤侵襲性及患者預后不良有關[12-13]。本研究結果顯示，Ang-2在RCC組織中的表達率較癌旁組織及正常腎組織明顯增高；Ang-2在血尿組中的陽性表達率高于無血尿組；Ang-2在臨床分期Ⅲ～Ⅳ期組中的陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期組，提示Ang-2的高表達可以誘導腫瘤血管的形成，進而參與了RCC的增殖、浸潤及轉移等惡性生物學行為的調節。

阻斷腫瘤血管的形成，從而切斷腫瘤細胞的血供來阻止其生長、轉移，成為腫瘤研究和治療的一個熱點，由于腎細胞癌對放化療均不敏感，以Ang-2及其受體作為一個治療靶點在腎癌治療領域開辟了一條新途徑[14-15]。Ang-2在人體正常組織中低表達，作為抗腫瘤治療的靶點使其對全身影響較小。腫瘤血管的生成是一個受多因素調控的復雜過程，Ang-2的表達與腫瘤新生血管的相互關系及其機制尚未完全清楚，將Ang-2作為靶點運用于腫瘤治療任重而道遠，需進一步深入研究。

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（收稿日期：2015-07-21） （本文編輯：周亞杰）