枯草芽孢桿菌B504菌株16SrDNA序列測定

李曉舟

[摘 要] 目前，分子生物學分類方法已應用于各種生物的鑒定。rDNA作為研究細菌系統發育關系的理想材料已被細菌學家廣泛采用。其中，16SrDNA，約1.5kb，在生物進化過程中較難變異，含有豐富遺傳信息，且其序列變化速度與進化距離相適應，因此，是相對較合適的系統發育指標，是現代微生物學分子鑒定的重要手段之一。本研究將結合傳統和現代分子生物學分類方法對菌株B504進行鑒定。

[關鍵詞] 枯草芽孢桿菌 16S rDNA序列

[中圖分類號] S1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1003-1650 （2015）11-0064-02

1 材料與方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌B504菌株為本試驗室保存；細菌基因組DNA小提試劑盒為凱基公司產品；PCR反應所用試劑為TaKaRa（大連）公司產品。

1.2 方法

1.2.1 B504基因組DNA的提取

采用凱基細菌基因組DNA小提試劑盒提取B504基因組DNA，詳細過程按說明書[25]進行。

1.2.2引物設計與合成

根據原核生物16S rDNA的保守序列，并參考文獻設計通用引物，由TaKaRa（大連）公司合成，引物序列如下：

上游序列：5-AGACGCTGGCGGCGTGC-3

下游序列：5-ATCATCTGTCCCACCTTCGGC-3

1.2.3 PCR 反應體系和反應條件

1.2.4 PCR擴增反應產物的檢測

取8μl PCR產物與2μl上樣緩沖液混合，用1.0%瓊脂糖凝膠在100V電壓下電泳，DNAgreen染色。凝膠于UVP紫外成像系統上觀察并拍照【26-28】。

1.2.5 測序

PCR產物送交TaKaRa（大連）公司測序，測序引物同PCR反應引物。

1.2.6 16S rDNA序列分析

運用BLAST 軟件對測序結果進行序列分析，與GenBank中已知的16S rDNA序列進行同源性比較對照，以確定其親緣關系。

2 結果與分析

2.1 細菌基因組DNA的提取

采用紫外分光光度計檢測260/280值為1.834，在1.7～2.0之間，DNA 濃度約為1.3μg·mL-1，電泳檢測基因組DNA無彌散現象（圖3-3），濃度和完整性均符合PCR擴增的要求【33】。

2.2 16Sr DNA PCR擴增

16Sr DNA PCR擴增產物片段長約1400bp結果[34]，見圖3-4。菌株B504的16SrDNA PCR擴增產物電泳結果如圖3-4所示。電泳結果表明，以B504菌株提取的總DNA為模板，利用引物，能夠擴增出特異性片段，片段大小在1450bp左右。

2.3 16SrDNA PCR擴增產物測序

2.4 B504菌株的測序結果

菌株B504 DNA 經PCR擴增后得到PCR產物，經測序片段長度為1429bp，已提交GenBank，并獲登錄號No.FJ437209。

2.4.1 Blast比對結果：與GenBank中已知的16S rDNA序列進行比對（Blast），搜索到同源性達到100%的序列有：No.FJ392726（Bacillus subtilis）、No.EU981825（B. amyloliquefaciens）及No.AB244463（B. velezensis）、No.FJ713021（Bacillus licheniformis），結果見圖3-5。

3 結論與討論

結合電鏡觀察和生理生化特征，將B504初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。將測得的B504菌株16S rDNA序列與GenBank中的相關序列進行比對（Blast），結果發現與B. amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）、B. velezensis（無中文名稱）、B. licheniformis（地衣芽孢桿菌）同源性達到100%。

本研究通過細菌16S rDNA序列測定，并運用Blast軟件進行比較對照，發現菌株B504與B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. velezensis、Bacillus licheniformis的同源性達100%。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）與枯草芽孢桿菌（B. subtilis）僅通過形態學特征、培養性狀難以區分；但在生理生化反應中，解淀粉芽孢桿菌可利用乳糖進行發酵，枯草芽孢桿菌則不可利用乳糖進行發酵。目前，已有多種基因，如gyrA 、cheA 、α-amylase 、yyaR 、yyaO、tetL 、tetB 等應用于枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分類和鑒定。Bacillus licheniformis（地衣芽孢桿菌）可厭氧生長，可利用丙酸鹽，而枯草芽孢桿菌不能厭氧生長，不能利用丙酸鹽，兩者通過生理生化測定易于區分。

枯草芽孢桿菌分為B. subtilis subsp. subtilis 和B . subtilis subsp. spizizenii 兩個亞種。大量的試驗只是為確定其為枯草芽孢桿菌，對其屬于亞種分類未作區分。