綿羊肺炎支原體固相競爭ELISA抗體檢測方法的建立

宋蓉

[摘 要] 本文依據(jù)固相競爭原理建立綿羊支原體固相競爭快速檢測方法，通過方陣法確定包被抗原、競爭抗體和酶標(biāo)二抗的使用濃度，單因素實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)時(shí)間和封閉劑對(duì)固相競爭反應(yīng)體系的影響，確立了最優(yōu)反應(yīng)條件。

[關(guān)鍵詞] 綿羊肺炎支原體 競爭ELISA 檢測

[中圖分類號(hào)] S858 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1003-1650 （2015）10-0279-01

綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起綿羊和山羊呼吸道疾病的最常見的病原之一。近年來，該病在世界上多個(gè)國家和地區(qū)普遍流行，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。基于此，本研究在血清純化的基礎(chǔ)上建立了綿羊肺炎支原體固相競爭ELISA抗體檢測方法，為相關(guān)疾病的有效的防控提供了保障。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 MOGH3-3綿羊肺炎支原體菌株由蘭州獸醫(yī)研究所提供

1.2 TSB-1培養(yǎng)基： 大豆胰蛋白肉湯（30g/L），乳糖（10g/L），酵母浸出液（100ml/L），10%馬血清及青霉素（200U/ml）。

1.3 陰陽性血清樣本 綿羊源支原體陽性樣本63個(gè)，山羊源支原體陽性樣本20個(gè)和46個(gè)支原體陰性血清樣由蘭州獸醫(yī)研究所提供

1.4 試劑 新生牛、馬、兔的血清購自蘭州某生物公司； 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG購自sigma公司； TMB購自sigma公司； 吐溫-20 購自Solarbio 公司； 碳酸鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀等均為分析純試劑。

1.5 儀器設(shè)備 iMARK 酶標(biāo)儀、微量移液器、costar 96孔酶標(biāo)板、落地式高速冷凍離心機(jī)、紫外可見分光光度計(jì)，恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水槽。

2 方法

2.1 高免血清的制備

取冷凍保存MoGH3-3菌株連續(xù)傳代培養(yǎng)復(fù)蘇菌株，F(xiàn)6菌株接種TSB-1培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)3d收獲菌體。根據(jù)陳忠瓊等建立的支原體膜蛋白提取方法制備免疫用膜蛋白抗原，將純化的膜蛋白抗原加等量弗氏完全佐劑（Sigma公司產(chǎn)品）并完全乳化后，皮下多點(diǎn)注射免疫1.5千克～2.0千克健康公兔。首免后28天，用弗氏不完全佐劑（Sigma公司產(chǎn)品）等量乳化抗原，皮下多點(diǎn)注射兔子，加強(qiáng)免疫后7日耳靜脈采少量血，1.0%瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測，效價(jià)達(dá)1：16以上時(shí)即可采血，分離血清，分裝并于-20℃保存。

2.2 兔抗血清純化

采集的高免兔抗血清使用HiTrap Protein A HP純化柱純化兔抗血清。上樣前用10mL 0.1M的Tris-HCl 平衡純化柱，兔抗血清和Tris-HCl緩沖液1：1混勻后上樣，上樣速度保持在0.5mL/min。上樣結(jié)束后用10mL 0.1M的Tris-HCl洗滌純化柱，洗去雜質(zhì)蛋白。最后用5mL左右50mM甘氨酸溶液洗脫純化柱，收集純化蛋白，收集瓶預(yù)先加入0.1mL 的1.0M的Tris-HCl溶液，收集洗脫液緩慢搖勻，使其pH值恢復(fù)至中性。洗脫后用10mL 0.1M的Tris-HCl 平衡純化柱，用5ml左右的20%乙醇充滿純化柱，以保存純化柱。

2.3 競爭ELISA方法的建立

2.3.1 確定抗原、抗體和酶標(biāo)二抗的使用濃度

2.3.1.1 抗原濃度確定

試驗(yàn)用方陣滴定法：用0.05mol/L 碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液（pH值為9.6）2倍系列稀釋純化后抗原（1：200～1：12800）橫向包被酶標(biāo)板，每孔100μl包被液， 4℃孵育過夜。PBST洗滌5次后，每孔加入兔抗血清100μl，37℃溫育60min。競爭反應(yīng)結(jié)束后每孔加入250μl PBST，洗滌5次，每孔加入50μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃溫育60min，PBST洗滌5次后每孔加入TMB底物溶液50μl 37℃反應(yīng)15min后，加入50μl 1.25M H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD450nm的光吸收值，通過吸光值的反應(yīng)曲線確定包被抗原飽和濃度。

2.3.1.2 競爭抗體濃度確定

通過確定的抗原使用濃度包被酶標(biāo)板，倍比稀釋純化后競爭抗體（1：400～1：25600）加入酶標(biāo)板，每孔加入兔抗血清100μl，37℃溫育60min。競爭反應(yīng)結(jié)束后每孔加入250μl PBST，洗滌5次，每孔加入50μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃溫育60min，PBST洗滌5次后每孔加入TMB底物溶液50μl 37℃反應(yīng)15min后，加入50μl 1.25M H2SO4終止反應(yīng)，讀取OD450nm的光吸收值，通過吸光值的反應(yīng)曲線確定兔抗使用濃度。

2.3.1.3 酶標(biāo)二抗?jié)舛却_定

參照2.3.1.2實(shí)驗(yàn)方法確定酶標(biāo)二抗使用濃度。

2.3.2 二抗溫育時(shí)間

抗原和競爭抗體按最適濃度稀釋，二抗孵育時(shí)間選擇37℃反應(yīng)30min、45min、60min。測定陰陽性血清OD450nm值，比較各溫育時(shí)間的P/N值，最后確定最佳的反應(yīng)時(shí)間。

2.4 封閉條件

抗原包被過夜后，選擇10%兔血清，10%牛血清和10%馬血清封閉酶標(biāo)板，37℃溫育60min。按照2.3建立的方法檢測陰陽性對(duì)照血清，最后讀取OD450值，比較3種封閉劑的P/N值，確定最佳封閉條件。

3 結(jié)果

3.1 檢測46份支原體陰性血清，83份陽性。檢測陰性血清46份，其中2份可疑樣本，特異性95.6%。陽性血清83份，敏感性100%。

表1 敏感性與特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 檢測方法測定24份支原體陰性血清，計(jì)算抑制率。平均抑制率為：X=0.127，標(biāo)準(zhǔn)差為S=0.042，臨界值為PI=X+3S=0.25，則設(shè)定PI>0.25為陽性，PI<0.2為陰性，0.2≤PI≤0.25為可疑。

參考文獻(xiàn)

[1]姚燕，馬金萍，宋德榮. 貴州省綿羊支原體肺炎研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015，05：294+296.

[2]張軒. 綿羊肺炎支原體多表位疫苗的研究及免疫試驗(yàn)[D].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.