Apobec-1重組腺病毒治療腎性高脂血癥的實驗研究

孔海波，胡 波，胡鵬

Apobec-1重組腺病毒治療腎性高脂血癥的實驗研究

孔海波，胡 波，胡鵬

目的探討肝臟獲得性表達載脂蛋白B編輯催化多肽-1（Apobec-1）對腎性血脂代謝紊亂的調控效應。方法30只健康普通級雄性新西蘭兔隨機分為假手術組、腎病組、Apobec-1治療組，每組10只。腎病組、Apobec-1治療組適應性喂養1周后行左腎切除術，術后1周耳緣靜脈注射阿霉素（4 mg／kg）構建腎病模型。術后11周Apobec-1治療組耳緣靜脈注射Apobec-1重組腺病毒（1×1013病毒顆粒／kg）。術后12周處死所有兔，并摘除右側腎臟和肝臟，分別留取血液及24 h尿液，檢測24 h尿蛋白（24UPr）、白蛋白（Alb）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、血脂等指標，HE染色觀察腎臟病理，Western blot檢測肝臟Apobec-1、載脂蛋白B48（ApoB48）蛋白表達水平。結果①與假手術組比較，腎病組24UPr、BUN、Cr、總膽固醇（TC）、總三酰甘油（TG）、極低密度脂蛋白（VLDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、載脂蛋白B100（ApoB100）明顯升高（P＜0.05），而Alb水平明顯下降（P＜0.05）；②與腎病組比較，Apobec-1治療組TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48水平明顯下降（P＜0.05）；③與假手術組比較，Apobec-1治療組24UPr、BUN、Cr明顯升高（P＜0.05），而Alb、ApoB48明顯下降（P＜0.05）；④Western blot結果顯示，與假手術組、腎病組比較，Apobec-1治療組肝臟Apobec-1、ApoB48表達明顯上調（P＜0.01）。結論腎性高脂血癥中，肝臟獲得性表達Apobec-1，重建ApoB mRNA編輯，增加ApoB48-脂蛋白的合成，進而起到一定的降脂效應。

高脂血癥；載脂蛋白B編輯催化多肽-1；載脂蛋白B100；載脂蛋白B48

腎性高脂血癥不僅是心血管疾病發生的主要高危因素，且參與腎病進展［1］。目前，傳統降脂藥物在30%的患者中會出現各種不同程度藥物不良反應［2］。所以對于這部分患者，治療則需另辟蹊徑。載脂蛋白B編輯催化多肽-1（apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1，Apobec-1）是調控載脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）mRNA編輯的特異性酶復合物中的催化亞基［3］。大量動物實驗研究［4-7］證實：通過構建Apobec-1重組腺病毒轉染鼠或兔，使肝臟獲得性表達Apobec-1，重建ApoB mRNA，具有一定的降脂效應。然而，腎性高脂血癥發病機制復雜，上述方法是否有一定降脂效應，仍需進一步探究。該研究采用單側腎切除單次注射阿霉素制作腎病模型，轉染Apobec-1重組腺病毒，觀察其對腎病兔血脂代謝及肝臟Apobec-1、載脂蛋白B 48（ApoB48）表達的影響，明確其對腎性血脂代謝紊亂的調控效應。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立及標本制備6月齡健康雄性普通級新西蘭兔30只，體重1 000～2 000 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，動物來源于南京安立默科技有限公司。適應性喂養1周后，將新西蘭兔隨機分為假手術組、腎病組、Apobec-1治療組，每組10只。置于代謝籠中飼養。腎病組和Apobec-1治療組以3%的戊巴比妥30 mg／kg行腹腔注射麻醉，無菌條件下行左腎切除，假手術組只探及腎包膜，并不切除左腎。1周后，腎病組和Apobec-1治療組耳緣靜脈注射阿霉素4 mg／kg，假手術組靜脈注射等量生理鹽水。術后11周，Apobec-1治療組耳緣靜脈注射Apobec-1重組腺病毒。術后12周，禁食12 h后第2天抽取血標本及留取24 h尿液，隨后全部處死，血液、尿液及時送檢；摘除腎臟，濾紙吸干后于10%中性福爾馬林溶液固定，待做腎臟病理檢查；摘除肝臟，濾紙吸干后稱重，剪取部分組織置EP管中，于－80℃低溫冰箱保存，待做Western blot檢測。

1.2 主要儀器及試劑UV-1200分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；TS-A型脫色搖床（上海滬粵明科學儀器有限公司）；DYY-TC型電泳儀（北京市六一儀器廠）；SZ-1型快速混勻器（江蘇省金壇市友聯儀器研究所）；Tanon-5500發光成像系統（上海天能科技有限公司）；D-78532 Tuttlingen離心機（廣東省醫療器械廠）；Apobec-1重組腺病毒（上海吉瑪制藥技術有限公司）；阿霉素（北京雅安達生物公司）；兔源抗Apobec-1多克隆抗體（北京奧維亞生物技術有限公司）；山羊抗ApoB48多克隆抗體（美國Abcam公司）；ECL-發光液（美國Thermo scientific公司）；常規試劑均為國產。

1.3 構建Apobec-1重組腺病毒①TRIzol法提取SD大鼠腸道總RNA；②RT-PCR擴增Apobec-1全長cDNA；③將rApobec-1基因裝載至pUC57-Simple載體上；④pYr-ads-4-rApobec-1構建；⑤通過LR體外同源重組將rApobec-1表達框構建至pAd／PL-DEST腺病毒表達載體上；⑥包裝重組腺病毒。

1.4 血尿指標及腎臟病理檢測方法雙縮脲比色法檢測24 h尿蛋白濃度（24 hour urinary protein，24UPr）；酶法測定白蛋白（albumin，Alb）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、總三酰甘油（total triglyceride，TG）和高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL-C）濃度；Friedewald公式估算血漿極低密度載脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL-C）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL-C）濃度；放射免疫法測定血漿載脂蛋白B100（ApoB100）和ApoB48濃度；HE染色觀察腎臟病理改變。

1.5 Westernblot檢測肝臟Apobec-1和ApoB48表達水平常規方法提取肝臟總蛋白，測定其蛋白濃度，將蛋白濃度稀釋至同一濃度；制備SDS-PAGE凝膠；電泳；轉膜；5%脫脂牛奶封閉過夜；加入一抗（兔源抗Apobec-1多克隆抗體1∶500；羊源抗ApoB48多克隆抗體1∶1 000；鼠源抗β-actin單克隆抗體1∶2 000），室溫孵育2 h，0.05%PBST洗3次，每次10 min，PBS洗1次，每次10 min；加入二抗（HRP標記的羊抗兔二抗1∶50 000；HRP標記的兔抗羊二抗1∶50 000；HRP標記的羊抗鼠二抗1∶ 100 000），室溫孵育3 h，0.05%PBST洗3次，每次10 min，PBS洗1次，每次10 min；在發光成像系統中進行ECL顯色、曝光、拍攝；對條帶進行相對光密度分析，通過與內參β-actin的條帶光度值的比值間接反映Apobec-1及ApoB48的表達水平。

1.6 統計學處理采用SPSS 13.0統計軟件進行單因素方差分析，數據以±s表示，兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 血尿生化指標比較3組之間血尿指標比較顯示24UPr、Alb、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48差異均有統計學意義（P＜0.05），見表1。與假手術組相比，腎病組24UPr、BUN、Cr、TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100明顯升高（P＜0.05），Alb明顯下降（P＜0.05），而HDL-C、ApoB48未見明顯變化；與腎病組相比，Apobec-1治療組TC、TG、VLDL-C、LDL-C、ApoB100、ApoB48明顯下降（P＜0.05），而24UPr、Alb、BUN、Cr、HDL-C未見明顯變化；與假手術組比較，Apobec-1治療組24UPr、BUN、Cr增高（P＜0.05），Alb、ApoB48下降（P＜0.05），而TC、TG、VLDL-C、LDL-C、HDL-C、ApoB100未見明顯變化，見表1。

2.2 腎臟病理學改變假手術組腎臟病理顯示腎組織結構無明顯異常；腎病組和Apobec-1治療組腎臟病理顯示腎臟組織細胞增生肥大、排列紊亂，腎小球囊壁增厚，局部可見粘連，腎間質增寬，充滿基質，可見大量炎性細胞浸潤，部分可見腎小球局灶性壞死，見圖1。

2.3 肝臟Apobec-1、ApoB48蛋白表達變化

Westernblot結果顯示，與假手術組比較，腎病組Apobec-1、ApoB48蛋白表達未見明顯變化；與腎病組、假手術組比較，Apobec-1治療組Apobec-1、ApoB48蛋白表達明顯上調（P＜0.01），見圖2。

表1 各組血尿生化指標比較（n＝10，±s）

表1 各組血尿生化指標比較（n＝10，±s）

與假手術組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與腎病組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

指標假手術組腎病組Apobec-1治療組F值P值24UPr（g／L）0.28±0.13 1.40±0.35**1.38±0.38**42.778 0.000 Alb（g／L）54.43±6.00 48.52±5.78*47.59±6.15*3.819 0.034 BUN（mmol／L）7.91±1.35 9.64±1.21**10.27±1.94**6.562 0.005 Cr（μmol／L）82.70±10.44 127.00±22.07**123.25±24.14**16.076 0.000 TC（mmol／L）0.88±0.10 1.28±0.25**0.93±0.09＃＃17.531 0.000 TG（mmol／L）0.66±0.14 1.03±0.38**0.72±0.14＃6.192 0.006 VLDL-C（mmol／L）0.30±0.07 0.47±0.17**0.33±0.06＃6.192 0.006 LDL-C（mmol／L）0.10±0.03 0.31±0.10**0.09±0.02＃＃34.924 0.000 HDL-C（mmol／L）0.48±0.11 0.50±0.06 0.51±0.04 0.511 0.605 ApoB48（mg／L）23.14±0.63 23.35±1.29 21.75±1.04*＃＃6.161 0.006 ApoB100（mg／L）25.46±1.11 27.36±2.03*25.15±1.90＃＃5.180 0.012

3 討論

高脂血癥是腎病綜合征的典型表現，包括高TC血癥，高TG血癥，常伴有LDL-C、VLDL-C、中間密度脂蛋白及脂蛋白a的升高，以及HDL-C降低或不變［8］。其中，高TC血癥是腎病最常見的高血脂類型［9］。高TC血癥主要以LDL-C升高為主，其機制［9］主要表現為：①HMG-CoA還原酶升高；②膽固醇7α羥化酶下降；③低密度脂蛋白受體缺陷；④酯酰輔酶A膽固醇脂酰轉移酶2代償升高。可見，腎性高脂血癥發生機制極其復雜。目前腎病綜合征模型的建立，主要采用單側腎切除后單次注射阿霉素構建，一般3個月左右可出現腎病綜合征典型表現［10］。且該方法具有死亡率低、成模率高、重復性好及方法簡短等優點。本研究通過上述方法建立腎病模型，結果顯示腎病組血尿生化指標和腎臟病理與臨床人類腎病綜合征臨床和病理特征相類似［11］，且血脂類型符合高TG血癥，為進一步實驗提供一定的模型基礎。

ApoBmRNA編輯是調控血漿脂蛋白代謝的重要遺傳機制［12］。其編輯過程主要受特異性酶復合物調控。維持特異性酶復合物活性至少需要兩種亞單位同時存在，即催化亞基（ApoB編輯催化多肽-1）和結合亞基（Apobec-1輔助因子）。在人類和兔中，ApoBmRNA雖可在腸道發生廣泛編輯而合成ApoB48，但在肝臟卻不被編輯而僅分泌全基因轉錄產物ApoB100［13］。人類和兔Apobec-1基因缺少肝臟特異性啟動子序列是導致上述器官差異性表達Apobec-1的主要原因［13］。然而，在其它一些哺乳動物（如：狗、馬和鼠類），ApoBmRNA在肝臟和腸道均可被編輯而合成分泌ApoB48-脂蛋白，同時伴隨低血漿ApoB100-脂蛋白［14］。現有的研究顯示，通過轉染Apobec-1重組腺病毒，可在肝臟短期表達Apobec-1，這種方式的降脂作用已在多種動物模型中得到體現［4-7］。本研究選用腎病兔為動物模型，轉染Apobec-1重組腺病毒1周后發現，Apobec-1治療組的血脂水平明顯低于腎病組，且與假手術組血脂水平基本持平。可見，腎性高脂血癥中，通過轉染Apobec-1重組腺病毒可起到一定降脂效應。本研究通過Westernblot法檢測肝臟Apobec-1、ApoB48的表達，結果顯示Apobec-1治療組肝臟Apobec-1、ApoB48表達明顯高于腎病組及假手術組。可見，通過轉染Apobec-1重組腺病毒，可使腎病兔肝臟獲得性表達Apobec-1，促進肝臟ApoBmRNA重建，增加ApoB48-脂蛋白的合成。然而，本研究觀察各組血清ApoB100、ApoB48變化顯示，與腎病組比較，Apobec-1治療組血清ApoB100、ApoB48均有所下降。既往有研究［15］顯示ApoB20、ApoB40可以形成pre-VLDL，但是形成的pre-VLDL在囊泡運輸過程中受到阻礙，以至于VLDL組裝的效率極低，但當截斷物達到ApoB48，VLDL組裝的效率大大提高。故此，本研究提出Apobec-1治療組血清ApoB48下降可能為其代謝速率迅速所致，但其代謝機制尚需進一步探究。

綜上所述，腎性高脂血癥中，通過轉染重組腺病毒，可使肝臟獲得性表達Apobec-1，促進肝臟ApoB mRNA編輯，增加ApoB48-脂蛋白的合成，具有一定降脂效應。

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Experimental study of Apobec-1 recombinant adenovirus in treatment of renal hyperlipem ia

Kong Haibo，Hu Bo，Hu Peng
（Dept of Pediatric，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore the effect of the liver acquired expression of apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1（Apobec-1）on hyperlipidemia of renal disease.MethodsThirty healthy ordinary levelmale New Zealand rabbits were randomly divided into three groups：sham operation group，nephropathy group，and Apobec-1 treatment group（Each group has10 rabbits）.Adapt feeding for one week，nephropathy group and Apobec-1 treatment group underwent left nephrectomy，and one week later，adriamycin（4mg／kg）was used to construct the nephropathymodel by ear vein injection.The eleventh week after operation，apobec-1 recombinant adenovirus（1× 1013Virus／kg）was injected by ear vein in apobec-1 treatment group.The twelfth week after operation，all rabbits were sacrificed.Right kidney，liver，blood and 24h urine were left.In three groups，24 hour urinary protein（24UPr），albumin（Alb），blood urea nitrogen（BUN），creatinine（Cr），blood lipid were detected.Renal pathology was observed by HE staining.Expressions of liver apobec-1，apolipoprotein B48（ApoB48）were observedby Western blot.Results①Compared with the sham operation group，nephropathy group showed that 24UPr，BUN，Cr，total cholesterol（TC），total triglyceride（TG），very low density lipoprotein（VLDL-C），low density lipoprotein（LDL-C），apolipoprotein B100（ApoB100）were increased（P＜0.05），but Alb was decreased（P＜0.05）.②Compared with the nephropathy group，Apobec-1 treatmentgroup showed that TC，TG，VLDL-C，LDLC，ApoB100，ApoB48 were decreased（P＜0.05）.③Compared with the sham operation group，Apobec-1 treatment group showed that 24UPr，BUN，Cr were increased（P＜0.05），but Alb，ApoB48 were decreased（P＜0.05）.④Compared with the sham operation group and nephropathy group，Apobec-1 treatmentgroup showed that the expression of Apobec-1 and ApoB48 were up-regulated（P＜0.01）.ConclusionWhen liver aquires expression of Apobec-1 in hyperlipidemia of renal disease，it can reconstruct ApoB mRNA，increase the synthesis of ApoB48-lipoprotein，and play a certain lipid-lowering effect.

hyperlipidemia；apolipoprotein B editing catalytic polypeptide-1；apolipoprotein B100；apolipoprotein B48

R 726.92

A

1000－1492（2015）08－1049－05

2015－04－29接收

安徽省自然科學基金（編號：1208085MH153）

安徽醫科大學第一附屬醫院兒科，合肥 230022

孔海波，男，碩士研究生；

胡 波，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：hubo3218＠sohu.com