逼尿肌相關蛋白在慢性前列腺炎大鼠模型中的表達及意義

王 晶，梁朝朝，樊 松，郝宗耀，張翼飛，劉 明，周駿

逼尿肌相關蛋白在慢性前列腺炎大鼠模型中的表達及意義

王 晶，梁朝朝，樊 松，郝宗耀，張翼飛，劉 明，周駿

目的采用17β-雌二醇聯合去勢建立大鼠慢性非細菌性前列腺炎模型，檢測膀胱逼尿肌蛋白在慢性前列腺炎大鼠膀胱的表達。方法取2月齡SD雄性大鼠60只隨機分為6組，每組10只，即：空白對照組、生理鹽水組、假手術組、單純17β-雌二醇組、單純去勢組、17β-雌二醇聯合去勢組。HE染色判定大鼠慢性前列腺炎模型建造成功后，采用SP免疫組化法、Western blot檢測6組大鼠膀胱組織肌動蛋白（αactin）、肌球蛋白（MLC 2）及高分子量鈣調素結合蛋白（hcad）表達的差異。結果免疫組化結果顯示17β-雌二醇聯合去勢組中α-actin、MLC 2、h-cad蛋白表達增多，Western blot顯示α-actin在各組的表達，與空白對照組相比，生理鹽水組、假手術組、單純17β-雌二醇組、單純去勢組聯合去勢組差異有統計學意義。MLC 2、h-cad在各組的表達與空白對照組相比，生理鹽水組、假手術組差異無統計學意義，單純17β-雌二醇組、單純去勢組、聯合去勢組差異有統計學意義。結論α-actin、MLC 2、h-cad表達變化可能參與慢性前列腺炎排尿相關癥狀的發病。

肌動蛋白；肌球蛋白；鈣調素結合蛋白；慢性前列腺炎；膀胱功能異常

慢性前列腺炎是泌尿外科門診最常見的一種疾病，多發于青壯年男性，發病率約為2%～15%［1］，約占門診量8%～25%，其中90%左右為慢性非細菌性前列腺炎（CAP）［2］，大約50%男性在一生的不同時期曾有過慢性前列腺炎癥狀，復發率高達25%～50%［3－4］。該病常表現為排尿異常、局部疼痛、性功能障礙［5］以及精神癥狀［3］等，其中尤以排尿異常癥狀如尿頻、尿急、尿痛、尿分叉等為常見［6］，但慢性前列腺炎排尿相關癥狀的發病機制至今尚不清楚。該研究通過建立大鼠慢性非細菌性前列腺炎模型，運用SP免疫組化法、Western blot法測定大鼠膀胱組織肌動蛋白（α-actin）、肌球蛋白（myosin light chain 2，MLC 2）及高分子量鈣調素結合蛋白（hcadesmon，h-cad）表達的差異，初步探討慢性前列腺炎尿頻、尿急等相關癥狀發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料17β-雌二醇購自美國Sigma公司；抗αactin抗體、抗MLC 2抗體購自英國Abcam公司，抗cad抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司；SP免疫組化檢測試劑及DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；ECL Plus發光試劑盒購自美國Thermo公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、甘氨酸、Tris堿、過硫酸銨、TEMED SDS均購自合肥奧達生物科技有限公司。

1.2 動物模型制備2月齡雄性SD大鼠60只，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，采用隨機單位設計分組法分為6組，每組10只，即空白對照組（不給予任何處理），生理鹽水組（僅皮下注射生理鹽水），假手術組（無菌條件下切開陰囊皮膚，不行去勢手術），單純去勢組（僅行單純睪丸切除術），單純雌二醇組［僅皮下注射17β-雌二醇（0.25 mg／2 m l／kg）］，聯合去勢組（17β-雌二醇皮下注射聯合去勢）。

假手術組、單純去勢組、聯合去勢組SD大鼠使用10%水合氯醛3 ml／kg麻醉，假手術組僅在無菌條件下切開陰囊皮膚，不行去勢手術，單純去勢組、聯合去勢組在無菌條件下行大鼠雙側睪丸切除術，手術當日及術后2 d給予肌肉注射青霉素5萬U／（kg／d）。在手術日后第1天，單純雌二醇組、聯合去勢組SD大鼠開始連續皮下注射17β-雌二醇（0.25 mg／2 m l／kg）至第30天，生理鹽水組SD大鼠開始連續皮下注射生理鹽水（2 m l／kg）至第30天。6組大鼠在最后一次給藥24 h內，在無菌條件下取出大鼠前列腺及膀胱組織，快速放入D-Hanks液中。仔細剝除前列腺包膜及周圍脂肪、結締組織等其他組織，獲得無菌的前列腺和膀胱組織，前列腺組織放置入10%甲醛后石蠟包埋切片、HE染色，然后使用光鏡觀察以評估組織炎癥情況，留取膀胱組織用于免疫組化及Western blot實驗。

1.3 慢性前列腺炎模型的判定HE染色鏡下可見聯合去勢組炎癥細胞聚集于腺泡腔內和周圍，部分腺體上皮組織破壞或淋巴樣小結／濾泡形成；空白對照組大鼠前列腺組織結構完整，無炎癥細胞浸潤，腺泡上皮組織整齊，無淋巴樣小結／濾泡形成。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫組化染色 標本均經4%多聚甲醛固定后常規石蠟包埋連續切片用免疫組化SP法進行。α-actin、MLC 2、cad一抗工作濃度為1∶100。陰性對照以pH＝7.4、0.01 mmol／L PBS緩沖液代替一抗。肌細胞中細胞質以棕黃色染色為陽性表達。Nikon Eclipse 80i型顯微鏡下觀察并放大400倍后拍照，隨機選取6個視野，采用圖像分析系統計算積分光密度值，最后取各組染色3次非連續切片的平均值。

1.4.2 Western blot法 取100 mg標本碾碎后加400μl單去污劑裂解液（含PMSF），在勻漿器中勻漿至無明顯的組織塊為止。將裂解液用移液器移至1.5 ml離心管中，4℃裂解30 min，裂解時候輕輕搖晃幾次。在4℃、12 000 r／min離心10 min，取上清液按Western blot常規方法進行。ECL發光試劑盒顯影，以GADPH為內參，相應蛋白與內參光密度比值代表該蛋白相對表達水平。

1.5 統計學處理采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，數據用±s表示，多組間比較采用One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。

2 結果

2.1 SD大鼠前列腺組織學HE切片光鏡觀察空白對照組、生理鹽水組、假手術組大鼠腺體表面較光滑、排列整齊，間質未見明顯炎癥細胞浸潤。單純去勢組、單純雌二醇組間質有少量炎細胞浸潤，間質充血水腫、增寬。聯合去勢組有較多的炎細胞浸潤、炎癥范圍廣并伴有腺體的破壞。見圖1。

2.2 免疫組化結果采用免疫組化觀察空白對照組、生理鹽水組、假手術組、單純去勢組、單純雌二醇組、聯合去勢組大鼠膀胱組織α-actin、MLC 2、hcad的表達，發現單純去勢組、單純雌二醇組α-actin、MLC 2、h-cad蛋白表達水平高于空白對照組、生理鹽水組、假手術組（P＜0.05），聯合去勢組α-actin、MLC 2、h-cad蛋白表達水平顯著高于其余各組（P＜0.01）。見圖2～5。

2.3 Westernblot結果采用Western blot法，使用空白對照組、生理鹽水組、假手術組、單純去勢組、單純雌激素組、聯合去勢組大鼠膀胱組織蛋白提取液，分別測定α-actin、MLC 2、h-cad及相應樣本GAPDH的表達，發現聯合去勢組α-actin、MLC 2、hcad蛋白表達水平高于空白對照組、生理鹽水組、假手術組、單純去勢組、單純雌二醇組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

Li et al［6］對25例CAP患者及15例健康男性進行尿流動力學檢查，發現CAP患者普遍出現排尿中斷、逼尿肌－括約肌協同失調，最大尿流率降低，最大逼尿肌壓力及最大尿道閉合壓均較對照組有所升高。這提示慢性前列腺炎患者存在膀胱功能的異常，但具體發病機制不清。

本研究采用國際公認的去勢后皮下注射17β-雌二醇的造模方法成功建立了CAP模型［7］，通過模型進一步研究CAP大鼠的膀胱相關蛋白表達情況。對于了解慢性前列腺炎排尿相關癥狀的發病機制有一定的意義。

目前國內外學者對于膀胱排尿生理的研究［8－9］較為深入，眾所周知，膀胱肌肉由逼尿肌和三角區肌兩部分平滑肌組成，排尿時三角區淺層肌肉收縮使膀胱頸張開，尿道外括約肌及尿道旁括約肌松弛，同時逼尿肌收縮完成排尿動作。如果膀胱逼尿肌、尿道平滑肌及尿道外括約肌功能失調，則可發生排尿功能障礙。探討排尿異常時膀胱逼尿肌的細胞和分子基礎，對于慢性前列腺炎引起的膀胱功能異常的治療有一定的意義。國內外大量學者［8－10］對膀胱出口部分梗阻對于膀胱功能改變的影響及相關蛋白水平改變的意義進行了大量研究，但對于慢性前列腺炎影響膀胱功能的相關報道并不多見。

與膀胱逼尿肌相關的蛋白包括肌動蛋白、原肌球蛋白、肌球蛋白、鈣調蛋白、鈣調素結合蛋白等。膀胱逼尿肌屬平滑肌，細肌絲由肌動蛋白及原肌球蛋白構成，其中肌動蛋白構成了細肌絲的主干，粗肌絲主要有肌球蛋白構成，肌球蛋白輕鏈的磷酸化使橫橋三磷酸腺苷酶活性升高從而引發肌絲滑行和肌肉收縮。Gao et al［11］發現限制肌球蛋白輕鏈激酶活性可導致平滑肌收縮功能失調，Boopathi et al［12］認為蛋白激酶C抑制蛋白CPI-17可通過抑制肌球蛋白輕鏈激酶活性降低肌球蛋白輕鏈磷酸化水平，從而導致平滑肌收縮減弱。鈣調素結合蛋白在平滑肌及非平滑肌細胞中均有表達，但分為兩種不同亞型，平滑肌細胞內表達h-cad，分子量為90～150 ku，非平滑肌細胞內表達低分子量鈣調素結合蛋白（lcaldesmon，l-cad），分子量為60～80 ku。兩種亞型的cad都可連接肌動蛋白、原肌球蛋白及肌球蛋白，從而調節平滑肌肌肉收縮或穩定非平滑肌細胞內的微絲網絡。Yang et al［13］研究膀胱出口部分梗阻兔模型逼尿肌的h-cad／l-cad表達的變化，發現代償期的膀胱逼尿肌收縮增強，h-cad表達增加，隨著時間推移，l-cad也逐漸增加，導致逼尿肌失代償，收縮功能減弱。本研究結果顯示在單純去勢組及單純雌二醇組中，膀胱組織α-actin、MLC 2及h-cad表達相對空白對照組、生理鹽水組、假手術組輕度升高，這提示單因素的雄激素阻斷效應可以導致輕度慢性前列腺炎而引起膀胱功能的變化，而在雙因素全雄激素阻斷的模型組中，3種蛋白的表達相對其他組別均有顯著升高，提示慢性前列腺炎大鼠膀胱功能可能存在異常。

臨床上，部分前列腺患者存在膀胱頸和前列腺尿道的平滑肌痙攣、逼尿肌－括約肌協同失調、逼尿肌纖維化，引起前列腺尿道內壓增高，產生前列腺及射精管內尿液返流，從而加重前列腺炎，引起膀胱收縮力增強，可能導致相關的逼尿肌蛋白代償性增高，其表達水平的改變可能是慢性前列腺炎引起膀胱功能異常的分子基礎。

［1］ Krieger JN，Riley D E，Cheah P Y，et al.Epidemiology of prostatitis：new evidence for a world-wide problem［J］.World JUrol，2003，21（2）：70－4.

［2］ Liang C Z，Li H J，Wang Z P，etal.Treatment of chronic prostatitis in Chinesemen［J］.Asian JAndrol，2009，11（2）：153－6.

［3］ Mehik A，Hellstr?m P，Sarpola A，et al.Fears，sexual disturbances and personality features in men with prostatitis：a population-based cross-sectional study in Finland［J］.BJU Int，2001，88（1）：35－8.

［4］ Nickel J C.Prostatitis：lessons from the 20th century［J］.BJU Int，2000，85（2）：179－85.

［5］ Tran C N，Shoskes D A.Sexual dysfunction in chronic prostatitis／chronic pelvic pain syndrome［J］.World JUrol，2013，31（4）：741－6.

［6］ Li Y，Qi L，Wen JG，et al.Chronic prostatitis during puberty［J］.BJU Int，2006，98（4）：818－21.

［7］ Wilson M J，Woodson M，Wiehr C，et al.Matrixmetalloproteinases in the pathogenesis ofestradiol-induced nonbacterial prostatitis in the lateral prostate lobe of theWistar rat［J］.Exp Mol Pathol，2004，77（1）：7－17.

［8］ Mannikarottu A S，DiSanto M E，Zderic SA，et al.Altered expression of thin filament-associated proteins in hypertrophied urinary bladder smoothmuscle［J］.Neurourol Urodyn，2006，25（1）：78－88.

［9］ Shukla A R，Nguyen T，Zheng Y，et al.Over expression of smooth muscle specific caldesmon by transfection and intermittent agonist induced contraction alters cellularmorphology and restores differentiated smooth muscle phenotype［J］.J Urol，2004，171（5）：1949－54.

［10］Matsumoto S，Hanai T，Ohnishi N，et al.Bladder smoothmuscle cell phenotypic changesand implication ofexpression of contractile proteins（especially caldesmon）in rats after partial outlet obstruction［J］.Int JUrol，2003，10（6）：339－45.

［11］Gao N，Huang J，He W，et al.Signaling through myosin light chain kinase in smooth muscles［J］.J Biol Chem，2013，288（11）：7596－605.

［12］BoopathiE，Hypolite JA，Zderic SA，etal.GATA-6 and NF-κB Activate CPI-17 Gene Transcription and Regulate Ca2＋Sensitization of Smooth Muscle Contraction［J］.Mol Cell Biol，2013，33（5）：1085－102.

［13］Yang L，He D L，Wang S，et al.Effect of long-term partial bladder outlet obstruction on caldesmon isoforms and their correlation with contractile function［J］.Acta Pharmacol Sin，2008，29（5）：600－5.

Expression of detrusor-related proteins in chronic prostatitis ratsmodel

Wang Jing，Liang Chaozhao，Fan Song，et al
（Dept of Urology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230032）

Objective To establish rats chronic non-bacterial prostatitismodel by castration combined injection of 17 beta-estradiol，and to discuss the relationship between chronic prostatitis and bladder dysfunction by the research of detrusor-related proteins.Methods60 2-month-old SD rats were randomly taken and divided into 6 groups，10 rats for each，as follows：Blank control group，Saline group，Sham operation group，17 beta Estradiol（0.25 mg／ml／kg）group，Simple Castration group，Combined Castration group.To evaluate the results of ratCPmodel by hematoxylin-eosin staining，then expression ofα-actin，MLC 2 and h-cad in bladder tissues of 6 groups of rats were analyzed via western-blot and S-P immunohistochemical staining.ResultsImmunohistochemistry showed that expressions ofα-actin，MLC 2 and h-cad in Combined Castration group were higher than other groups.Western blot qualitative study showed thatexpression ofα-actin in combined castration group was higher than othergroups.Compared with the blank control group，expression of MLC 2 and h-cad was moderately elevated in 17 beta estradiol group，simple castration group，and significantly elevated in combined castration group.ConclusionAltered expression ofα-actin，MLC 2 and h-cad is likely involved in the pathogenesis of bladder dysfunction following chronic prostatitis.

actin；myosin；caldesmon；chronic prostatitis；bladder dysfunction

R 697＋.33

A

1000－1492（2015）08－1072－05

2015－03－24接收

國家自然科學基金（編號：81170698，81470986）；安徽省科技攻關項目（編號：12010402128）；衛生部國家臨床重點專科建設項目；安徽省自然科學基金項目（編號：1508085MH177）

安徽醫科大學第一附屬醫院泌尿外科，合肥 230032

王 晶，男，碩士研究生；

梁朝朝，男，教授，主任醫師，博士生導師，責任作者，E-mail：liang＿chaozhao＠163.com