外周血間充質干細胞凝膠對兔肌腱移植物重建前交叉韌帶腱骨愈合的影響

劉家能，徐 斌，徐洪港，朱雪坤，陳鵬

外周血間充質干細胞凝膠對兔肌腱移植物重建前交叉韌帶腱骨愈合的影響

劉家能，徐 斌，徐洪港，朱雪坤，陳鵬

目的探討在兔自體肌腱移植物重建前交叉韌帶（ACL）模型股骨道內注入自體外周血間充質干細胞（PBMSCs）凝膠對早期腱骨愈合的影響。方法健康3～4月齡新西蘭大白兔32只，隨機均分為PBMSCs組與對照組，PBMSCs組予以皮下注射粒細胞集落刺激因子（G-CSF）動員6 d后采集外周血，采用密度梯度離心法及貼壁培養法分離純化PBMSCs，光鏡下觀察細胞形態并行流式細胞術檢測鑒定表面抗原表達。建立自體肌腱移植物重建前交叉韌帶模型，PBMSCs組于動物模型股骨道內注入PBMSCs凝膠，對照組僅注入凝膠。分別于術后第2、4、8、12周每組隨機取4只處死取材，1只做Masson三色染色觀察組織愈合的病理表現，3只做股骨道移植物抗牽拉試驗觀察其愈合強度。結果流式細胞術檢測結果提示PBMSCs表面表達CD29、CD90，不表達CD11b、CD34。Masson三色染色顯示PBMSCs組術后第4周膠原纖維開始增生，排列紊亂，第8周膠原纖維顯著增生，排列不規則，第12周膠原纖維大量增生，排列有序。PBMSCs組腱骨愈合速度較對照組迅速。PBMSCs組和對照組的股骨道移植物抗牽拉強度隨時間延長呈現上升趨勢，其中PBMSCs組移植物的抗牽拉強度自第8周起明顯高于對照組（P＜0.01）。結論PBMSCs凝膠對兔自體肌腱移植物重建ACL的早期腱骨愈合有促進作用。

前交叉韌帶；腱骨愈合；外周血間充質干細胞

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是維系膝關節穩定的重要彈性結構，但是在損傷或斷裂后無法引起血小板聚集，不能激活凝血系統，難以自愈［1］，會導致膝關節穩定性降低，加大膝關節內軟骨和半月板等其他結構損傷的風險，目前公認有效的治療方法是進行關節鏡下肌腱移植物重建ACL手術［2］。肌腱移植物在骨道內的愈合，即腱骨愈合的強度決定了術后移植物的穩定性，對指導術后功能鍛煉、患肢負重以及參加體育活動起到關鍵性作用，是保證ACL重建術臨床效果的重要因素。間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是來源于中胚層的一類多潛能干細胞，其主要存在于結締組織與器官間質中，如骨髓、脂肪、羊膜組織、臍帶、外周血等。MSCs具有強大的增殖能力、多向分化潛能和免疫調節功能，在適宜的體內或體外環境下可以向成骨細胞、成軟骨細胞、肌腱、脂肪細胞、骨髓基質細胞、血管內皮細胞及神經細胞樣細胞分化，并且多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，是重要的組織工程種子細胞［3］。該實驗建立兔自體肌腱移植物重建ACL模型，加入外周血間充質干細胞（peripheral blood mesenchymal stem cells，PBMSCs）作為影響因素，探討PBMSCs對早期腱骨愈合有無促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組3～4月齡健康新西蘭大白兔32只，不限雌雄，體重2.3～2.7 kg，清潔級，購自安徽醫科大學實驗動物中心。根據實驗要求隨機均分為PBMSCs組和對照組。術前白兔運動飲食正常，體檢未發現膝關節周圍腫脹，四足均無潰爛，雙膝前抽屜實驗、Lachman實驗均為陰性。拋硬幣法隨機選取一側膝關節，建立自體肌腱移植物重建ACL模型，PBMSCs組于模型股骨隧道內注入PBMSCs凝膠，對照組僅注入凝膠。

1.2 主要試劑與儀器粒細胞集落刺激因子（北京雙鷺藥業股份有限公司）；Percoll分離液（美國Pharmaeia公司）；10%胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；細胞培養時用的青霉素－鏈霉素、胰酶細胞消化液（上海碧云天生物技術有限公司）；LDMEM液、牛血清白蛋白（美國Hyclone公司）；抗兔CD11b、CD29、CD34、CD90抗體（美國Santa Cruz公司）；凝血酶凍干粉（長春國奧藥業有限公司）；人纖維蛋白原（上海萊士血液制品股份有限公司）；Masson三色染色試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）。CO2培養箱（上海姚氏儀器設備廠）；BHC-1300ⅡA生物安全柜（蘇州凈化設備有限公司）；倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；EpicsXL型流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）；FA1204B電子分析天平（上海精科天美貿易有限公司）；NK100指針式拉力計（上海艾固檢測儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取、培養PBMSCs PBMSCs組動物按照30μg／（kg·d）劑量予以粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）動員6 d，第7天經耳緣靜脈采集外周血15 ml，在無菌工作臺內按照1∶1比例與磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋混合，吹打均勻，緩慢加入密度為1.073 g／L的Percoll分離液，以此為離心介質分離細胞（2 500 r／min，20 min），吸取灰白色云霧狀的白膜層（單個核細胞層），適量PBS洗滌后加入含有10%胎牛血清、100 U／m l青霉素和100 U／ml鏈霉素的L-DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2、80%濕度的培養箱中培養。3 d后半量換液，5 d后全量換液，以后每3～4 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察傳代細胞以集落方式貼壁生長，呈長梭型或多角形。當貼壁生長的原代細胞呈80%～90%融合時，用0.25%的胰蛋白酶消化3 min，按照1∶2比例進行傳代。

1.3.2 流式細胞儀檢測PBMSCs細胞表面抗原表達 胰蛋白酶消化第3代貼壁細胞，收集細胞懸液，常溫下800 r／min離心5 min，棄去上清液，PBS（含1%牛血清白蛋白）清洗細胞3次，計數細胞以達到流式細胞儀檢測的細胞數量要求，每管含細胞數1.0×105個，向各管內依次加入CD11b、CD29、CD34、CD90抗體，避光、孵育35 min，之后以PBS（含1%牛血清白蛋白）清洗細胞，去除未結合抗體，以500μl PBS重懸細胞并轉入流式管中，流式細胞儀測定相應CD分子標記率。

1.3.3 制備PBMSCs凝膠混合物 消化收集第3代PBMSCs 1.0×105個，以0.3 ml PBS沖洗形成細胞懸液，同時取凝血酶凍干粉0.1 g、人纖維蛋白原0.1 g與2 ml氯化鈣注射液混合，1 m l注射器抽取0.3 ml混合液與0.3 m l細胞懸液，搖勻混合，25～30 s（室溫24℃）即可形成凝膠。

1.3.4 建立兔ACL重建實驗模型 3%戊巴比妥納溶液按照1 m l／kg劑量經耳緣靜脈緩慢靜推，完全麻醉后單側膝關節備皮，碘酒、酒精消毒，無菌手術巾鋪巾覆蓋。做小腿后方縱行切口，分離并離斷合適長度的趾長屈肌腱，對折肌腱，游離端使用4-0無菌縫合線編織縫合，對折端用1.0 mm鋼絲穿過，無菌生理鹽水紗布覆蓋待移植肌腱備用。做髕旁內側入路，以髕骨為中心，切開內側支持帶，將髕骨推向外側，充分暴露兔膝關節腔，辨別并剪斷ACL，檢查前抽屜試驗及Lachman實驗（＋），建立ACL斷裂模型，屈曲兔膝關節于90°位置，沿原ACL走形方向及上下止點附麗處，使用2.5 mm克氏針建立脛骨道與股骨道，1.0 mm克氏針于股骨髁上方約2 mm處建立兩處骨道，自脛骨端向股骨端引入移植肌腱，股骨端兩段鋼絲均由外向內穿過骨道，于內側相交并擰緊，PBMSCs組與對照組分別將PBMSCs凝膠或凝膠均勻注入股骨隧道，將脛骨端肌腱拉緊并與周圍骨膜、筋膜等組織縫合固定。復位髕骨，檢查前抽屜試驗及Lachman試驗（－），無菌生理鹽水沖洗關節腔，逐層縫合手術切口，無菌敷料包扎傷口。待麻醉蘇醒后送回安徽醫科大學實驗動物中心籠內飼養，自由活動，每日檢查實驗動物的手術傷口及一般情況。其中PBMSCs組1只實驗動物于術后當日死亡，對照組2只實驗動物分別于術后第3天和第4天死亡，均立即補齊；PBMSCs組與對照組分別有3只和2只實驗動物于術后1～3 d內出現手術切口紅腫、膿性滲出等癥狀，予以每日20萬U青霉素鈉肌注3 d后均癥狀好轉，其余實驗動物均未發生感染且存活至標本取材階段。

1.3.5 標本制備 術后第2、4、8、12周使用空氣栓塞法每組各處死4只實驗動物，立即手術取出實驗膝關節，剔除多余軟組織，1只用于Masson三色染色，3只用于股骨端移植物抗牽拉力試驗。Masson染色觀察標本僅留取股骨端（股骨干下1／3與股骨髁），固定于10%中性福爾馬林溶液中72 h，取出標本，10%EDTA磷酸緩沖液脫鈣4～6周。移植物抗牽拉試驗標本留取股骨端（股骨下1／2）、移植ACL、脛骨端（脛骨上1／2），即刻進行試驗。

1.3.6 Masson三色染色 針刺法判斷組織脫鈣滿意后，沿移植物縱軸切開標本，按照脫水、透明、包埋程序制成蠟塊，切成5μm厚薄片，置于載玻片上脫蠟至水，滴加100μl Masson復合染色液染色5 min，蒸餾水沖洗；滴加100μl磷鉬酸染色5 min，甩干；滴加100μl苯胺藍染色5 min，蒸餾水稍沖；滴加100μl分化液分化30～60 s（重復1次），脫水、透明、封片后置于光學顯微鏡下觀察。

1.3.7 股骨道移植物抗牽拉強度試驗 調整室溫至24℃，濕度70%，抽出用于固定股骨端肌腱的鋼絲，生理鹽水滴浴標本，標本股骨端以三段鋼絲捆扎固定于測試架上方水平支架上，脛骨末端打孔予以穿過鋼絲并固定在測試架下方卡口處，裁剪合適大小鋁板膚貼固定于脛骨結節后方，并鋼絲捆扎，另一端連接拉力計，于水平位置均勻用力牽拉脛骨端鋼絲（圖1），直至移植物自股骨道內脫出，記錄拉力計峰值數據。

1.4 統計學處理采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，詳細記錄兩組移植物肌腱自骨道內脫出時所需拉力的大小，結果用±s表示，兩組間采用兩樣本t檢驗。

2 結果

2.1 PBMSCs表面標志物的表達流式細胞儀檢測結果提示：本實驗中所培養的第3代PBMSCs均一表達CD29、CD90，陽性表達率為97.3%、98.4%，而CD11b、CD34呈陰性，陽性表達率為1.3%、1.3%，見圖2。

2.2 Masson三色染色觀察術后2周：兩組在腱骨交界處均有大量壞死組織形成，纖維排列紊亂，成纖維細胞與膠原纖維均無明顯增生，見圖3A。

術后4周：對照組仍有大量壞死組織，纖維排列不齊，有少量成纖維細胞增生，但未見明顯膠原纖維。PBMSCs組壞死組織較對照組減少，組織排列欠規則，有少量成纖維細胞及膠原纖維長入，見圖3B。

術后8周：對照組有大量成纖維細胞長入，纖維排列欠規則，腱骨愈合界面有少量膠原纖維長入。PBMSCs組有大量成纖維細胞長入，部分纖維排列整齊，部分欠規則，腱骨愈合界面有大量膠原纖維長入，見圖3C。

術后12周：對照組成纖維細胞數量減少，膠原纖維生成增多，腱骨愈合交界處成纖維細胞與膠原纖維數量比約為1∶1。PBMSCs組僅殘余少量成纖維細胞，大量膠原纖維規則排列在腱骨愈合交界處，見圖3D。

2.3 股骨道移植物抗牽拉強度股骨道移植物抗牽拉力強度隨時間延長呈上升趨勢，第2周、第4周時，兩組之間抗牽拉力強度差異無統計學意義。術后第8周及第12周，PBMSCs組抗牽拉力強度明顯大于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 術后各時間段兩組股骨道移植物抗牽拉強度對比（N，±s）

表1 術后各時間段兩組股骨道移植物抗牽拉強度對比（N，±s）

項目對照組（n＝3）PBMSCs組（n＝3）t值P值術后2周22.87±3.91 24.93±1.94－0.820 0.456術后4周38.60±3.41 39.67±4.82－0.313 0.770術后8周50.73±2.32 61.07±3.00－4.725 0.009術后12周65.87±4.31 89.80±5.70－5.817 0.004

3 討論

ACL重建手術在骨道內建立了一個全新的腱－骨交界面，而移植肌腱與骨道在這個界面上的修復重建卻是一個緩慢而復雜的生物過程，目前已經有大量的動物試驗及臨床試驗對腱骨愈合過程進行了深入的研究。在關節鏡下ACL重建手術及術后康復過程中影響腱骨愈合的因素有很多，如：移植物材料、骨道定位、骨道內移植物長度和直徑、移植物的固定方式、移植物在骨道內的張力、移植物在骨道內的移動以及早期康復鍛煉等［4］。在組織學方面，腱骨愈合經歷3個階段：①組織炎癥期；②血管長入與細胞增生期；③韌帶重建期，各階段間無明顯組織學與時間界限，約在第8周起，纖維瘢痕開始形成［5］。在ACL重建過程中，腱骨愈合是最薄弱的環節，也是決定手術成敗的關鍵所在，如何促進肌腱移植物在骨道內的愈合或加強愈合強度成為當前運動醫學領域的研究熱點。

Bietal［6］報道術后規律皮下注射甲狀旁腺激素［1－34］對大鼠ACL重建模型早期腱骨愈合有促進作用。Kuang et al［7］使用涂有摻鍶磷灰石骨水泥的同種異體腱重建兔ACL，術后組織學提示實驗組較對照組提早完成了腱骨愈合。Gulotta et al［8］認為腫瘤壞死因子α拮抗劑可以加強大鼠肩袖修補術后早期腱骨愈合的生物力學強度。Kovacevic et al［9］在大鼠岡上肌肌腱斷裂模型中使用rhPDGF-BB涂層補片修補岡上肌，較普通補片能增加腱骨愈合早期的細胞增生和血管再生。上述實驗均取得了一定的成果，也為后期的臨床試驗打下了堅實的基礎。

由于MSCs具有多向分化與無限增殖的特性，使其在運動醫學修復重建領域具有廣闊的臨床應用前景，目前國內外學者更多的把研究方向指向了骨髓間充質干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，bMSCs）［10］。Li et al［11］使用超順磁納米鐵顆粒和細胞膜紅色熒光探針標記bMSCs，與生物蛋白膠混合后注入兔ACL重建模型的膝關節中，認為bMSCs可以促進早期腱骨愈合。但是骨髓移植治療在臨床上的使用存在來源有限、取材屬于有創操作且存在感染風險等問題，MSCs的同源性讓研究者把目光轉向其他來源。Toghraie et al［12］從髕下脂肪墊中提取脂肪來源MSCs治療膝關節軟骨缺損和骨性關節炎，取得了理想的效果。Sekiya et al［13］發現膝骨關節炎患者關節液中MSCs細胞數量較正常人增加，并證明這些MSCs來自滑膜而非骨髓。Zhao et al［14］首先在動員后的外周血中提取，培養出具有多能干細胞潛能的一類細胞，即PBMSCs，隨著研究的深入，PBMSCs的提取與培養鑒定已經日趨成熟。

本研究對提取培養出的細胞行流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達，結果提示CD29、CD90呈陽性，CD11b、CD34呈陰性，符合MSCs鑒定標準［15］。成功移植入兔ACL重建模型股骨端后在不同時間段對腱骨愈合的組織學特征和抗牽拉強度進行觀察，評估PBMSCs對腱骨愈合的影響。術后第2周和第4周，PBMSCs組與對照組在組織學特征和抗牽拉強度上均無明顯區別，自第8周開始，PBMSCs組腱骨愈合界面膠原纖維數量較對照組明顯增多，抗牽拉強度亦顯著大于對照組。可見PBMSCs在這個時間段可以促進腱骨界面膠原纖維形成，從而加強生物力學強度。

ACL重建后的腱骨愈合重建過程極其復雜，其愈合類型和方式，以及可以對其愈合造成影響的因素都有待于進一步研究，PBMSCs因取材微創、感染率低，有利于實現臨床自體細胞移植的目標，有著廣闊的臨床應用前景。本研究結果表明：PBMSCs可以促進ACL重建術后的早期腱骨愈合，加強腱骨愈合生物力學強度，為臨床促進腱骨愈合提出了一種新的思路。

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The tendon-to-bone healing of ACL reconstruction in a rabbitmodel using autograft seeded w ith PBMSCs gel

Liu Jianeng，Xu Bin，Xu Honggang，et al
（Dept of Sports Injury and Arthroscopic Surgery，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022）

Objective This study was conducted to analyze the effect of peripheral blood mesenchymal stem cells（PBMSCs）gel on the early period of tendon-to-bone healing after reconstruction of the anterior cruciate ligament（ACL）using autograft.MethodsThirty-two New Zealand rabbits aged 3～4 months were randomly divided into two groups（n＝16 per group）：experimentaland control.After rabbits from the experimentalgroup weremobilized by subcutaneous injection of granulocyte colony stimulating factor（G-CSF）for 6d，the PBMSCs were isolated from rabbit peripheral blood samples by combination of density gradient centrifugation and adhesive culture，morphology of cell proliferation was observed by microscopy and phenotypes of PBMSCs were detected by flow cytometry.A model of ACL reconstruction using autograftwas performed in all of the rabbits，the experimental group received injection of PBMSCs gel into the femur tunnel and the control group received gel only.At 2，4，8 and 12 weeks，4 animals in each group were euthanized，1 for histologic assessment by Masson trichrome staining and 3 for biomechanical testing.ResultsFlow cytometry showed that the PBMSCs expressed CD29，CD90 positive，CD11b，CD34 negative.According to the Masson trichrome staining，in the experimental group，collagen fiberswere presented but had a disordered arrangement at4 weeks after surgery.At8 weeks after surgery，collagen fiberswere obviously increased but irregularly arranged.At12 weeksafter surgery，collagen fiberswere formed in abundance and regularly arranged.The healing at tendon-bone interface of the experimental group was quicker than those of the control group.Themaximum biomechanical pull-out strength of the autograft in the femur tunnel presented a rising trend with the prolong of repair time in both experimental and control groups，and itwas significantly higher in the experimental group at8 and 12 weeksafter surgery（P＜0.01）.ConclusionPBMSCs gel could enhance the early period of tendon-to-bone healing after reconstruction of the ACL using autograft.

anterior cruciate ligament；tendon-to-bone healing；peripheral blood mesenchymal stem cells

R 686.5

A

1000－1492（2015）08－1081－05

2015－04－23接收

安徽省自然科學基金（編號：1208085MH157）

安徽醫科大學第一附屬醫院運動創傷與關節鏡外科，合肥230032

劉家能，男，碩士研究生；

徐 斌，男，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：youchen100＠126.com