蕓香苷通過PI3K／AKT信號通路抑制H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡

郭 彬，周艷峰

蕓香苷通過PI3K／AKT信號通路抑制H2O2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡

郭 彬，周艷峰

目的探討PI3K／AKT信號通路是否參與蕓香苷對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞（HLEC）凋亡的抑制作用。方法將培養(yǎng)的HLEC分為4組：空白對照組、H2O2組、蕓香苷組、LY294002組；采用MTT法測細(xì)胞存活率，Western blot法檢測p-AKT及AKT的表達，Annexin VFITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。結(jié)果H2O2可誘導(dǎo)HLEC發(fā)生凋亡，與H2O2組相比，蕓香苷組不僅使AKT的磷酸化水平顯著升高，還降低了細(xì)胞凋亡率（P＜0.01）；在LY294002干預(yù)組，PI3K／AKT信號通路的特異性阻斷劑LY294002明顯抑制了蕓香苷組中各項指標(biāo)的變化，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），但與H2O2組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論蕓香苷抑制H2O2誘導(dǎo)的HLEC凋亡可能與PI3K／AKT信號通路有關(guān)。

蕓香苷；人晶狀體上皮細(xì)胞；PI3K／AKT信號通路；H2 O2

白內(nèi)障是當(dāng)今世界范圍致盲率最高的眼病。一般認(rèn)為，自由基引起的晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷及凋亡是白內(nèi)障發(fā)生的主要因素［1］。在大量關(guān)于抑制H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的文獻中，無論使用白藜蘆醇、黃芪苷還是蕓香苷干預(yù)，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）信號通路都參與其抗凋亡機制［2－3］。但PI3K／AKT信號通路是否參與蕓香苷對HLEC的抗凋亡作用，其作用機制尚未見相關(guān)報道。蕓香苷又被稱為維生素P，是天然黃酮類化合物。目前研究［4－6］表明，蕓香苷擁有抗病毒、抗炎、抗高血壓、抗氧化等功能。早在1994年，Grinberg et al［7］報道蕓香苷可保護血紅蛋白免受百草枯（paraquat，PQ）誘導(dǎo)的氧化作用。該研究初步探討蕓香苷對晶狀體上皮細(xì)胞（lens epithelial cells，LEC）的保護作用與PI3K／AKT信號通路的關(guān)系，為蕓香苷在白內(nèi)障早期防治中提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑人晶狀體上皮細(xì)胞（human lens epithelial cells，HLEC）（上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司）；30%H2O2（上海中試化工總公司）；Rutin（純度＞98%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司）；0.25%胰蛋白酶、LY294004、RIPA裂解液、PMSF、ECL顯色液（海門市碧云天生物技術(shù)研究所）；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國GIBCO BRL公司）；β-actin、p-AKT、AKT抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠／兔（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-FITC／PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物有限公司）

1.2 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)將凍存的HLEC立即放入37℃水中快速搖晃，直至凍存液完全融化，接種于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日觀察換液；待貼壁細(xì)胞長至融合時，用胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進行實驗。

1.3 實驗分組實驗分為4組，對照組：HLEC＋DMEM培養(yǎng)液；H2O2組：正常組＋H2O2（終濃度200 μmol／L）；蕓香苷組：H2O2組＋蕓香苷（終濃度100 μmol／L）；LY294002組：LY294002（終濃度14μmol／L）＋蕓香苷（100μmol／L）＋H2O2（200μmol／L）。蕓香苷、H2O2的濃度是從前期研究結(jié)果中篩選出來的最佳濃度。

1.4 MTT測細(xì)胞生存率取2塊96孔板，接種以5×103細(xì)胞／孔的對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔加100μl的培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，其中1塊96孔板加入200μmol／LH2O2后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48 h（設(shè)計的空白對照組除外）；另1塊板除空白組外，加入100μmol／L蕓香苷后分別培養(yǎng)30 min、1、2、4 h后，加入200μmol／L H2O2再培養(yǎng)24 h。將加完藥的兩板取出，每孔分別加入5 g／LMTT 20μl繼續(xù)孵育，4 h后取出棄上清液，每孔加入150μl的DMSO，常溫震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測定490 nm波長下的吸光度（absorbance，A）值。每板實驗重復(fù)2次。

1.5 AnnexinV-FITC和PI雙染流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡率H2O2組為用200μmol／L H2O2處理細(xì)胞24 h；蕓香苷組為用100μmol／L蕓香苷預(yù)處理細(xì)胞1 h后加入200μmol／L H2O2處理24 h；LY294002組為14μmol／L LY294002預(yù)處理細(xì)胞30 min后，加入100μmol／L蕓香苷處理1 h，最后加入200μmol／L H2O2孵育24 h。細(xì)胞接種于6孔板，按要求給予不同的因素處理后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入0.25%胰酶（不含EDTA）500μl，37℃消化3 min后吹打成單細(xì)胞懸液并收集，4 000 r／min離心3 min，棄上清液。冷PBS洗滌細(xì)胞后離心棄上清液，加入500μl IX AnnexinV結(jié)合液吹打結(jié)合懸浮細(xì)胞后，分別加入5μl Annexin V-FITC和5μl PI染色，輕輕搖勻后放置4℃避光保存15 min.每個樣本計數(shù)不低于10 000個細(xì)胞，采用熒光強度值并以Multicycle軟件處理結(jié)果，計算凋亡率。

1.6 Westernblot法檢測p-AKT的表達各組細(xì)胞經(jīng)實驗處理后，使用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔按1∶100的比例加入RIPA裂解液與PMSF的混合液，4℃裂解15 min，細(xì)胞裂解物12 000 r／min離心10min，取上清液，調(diào)整樣品的蛋白量按照1∶5的比例加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，水浴煮沸5 min。將樣品電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（130 mA恒定電流轉(zhuǎn)移3 h），室溫下用還有5%脫脂奶粉（PBS溶解）封閉PVDF膜1 h。隨后加入一抗（1∶300）4℃孵育過夜。PBS洗脫3次，加入相應(yīng)的二抗（1∶10 000），孵育2 h，漂洗3次。將PVDF膜用發(fā)光試劑染1 min，暗室中曝光到X線片上。Image J軟件進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 H2O2處理時間的選擇根據(jù)前期實驗結(jié)果，此次選擇200μmol／L為H2O2的實驗濃度，分別處理HLEC 12、24、48、72 h后，MTT測其對細(xì)胞生存率的影響。細(xì)胞生存率隨著時間的增加呈下降趨勢，與正常組相比，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.01）。而24 h值最接近細(xì)胞生存半數(shù)抑制率（50%inhibition rate，IC50）。因此在實驗中，選擇24 h為H2O2處理細(xì)胞的時間。

2.2 蕓香苷預(yù)處理時間選擇根據(jù)前期實驗結(jié)果，此次選擇100μmol／L為蕓香苷的實驗濃度，分別預(yù)處理細(xì)胞30 min、1 h、2 h、4 h。MTT測其對細(xì)胞生存率的影響。各組細(xì)胞生存率較空白對照組相比，有所下降（P＜0.01），但各組之間的細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且在1 h時為最高（78.73± 8.74）%，隨后，細(xì)胞生存率逐漸降低。因此選擇1 h為蕓香苷預(yù)處理的最佳時間，見圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀測各組細(xì)胞凋亡率H2O2組的細(xì)胞凋亡率最高。加入蕓香苷預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率較H2O2組明顯降低（P＜0.01），與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；LY294002抑制蕓香苷的保護作用，使細(xì)胞凋亡率再次升高（P＜0.01），與H2O2組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3。

2.4 Westernblot測各組p-AKT的表達與對照組相比，H2O2組及LY294002組的p-AKT相對表達量下降（P＜0.01），蕓香苷組p-AKT的相對表達量升高（P＜0.01）；與蕓香苷組相比，加入抑制劑LY294002后p-AKT的灰度值由（39.77±5.85）%降到（17.64±4.55）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而與H2O2組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；總的AKT相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

LEC是存在于前囊下、赤道弓部及赤道部的單層立方上皮細(xì)胞，具有分化、增殖功能，在維持晶狀體透明性及穩(wěn)定性中起重要作用。一旦LEC受到輻射、藥物、外傷等慢性損傷時，可產(chǎn)生大量的活性氧，后者通過損害線粒體及能量代謝，使抗凋亡基因表達受阻，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。活性氧破壞正常的LEC功能，引起晶狀體渾濁，導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生［1］。

H2O2屬于活性氧一員，是最常見的氧化劑。相關(guān)文獻［8］報道，老年性白內(nèi)障患者房水中H2O2含量高于正常人2倍。因此本實驗采用H2O2作為體外細(xì)胞氧化損傷模型。H2O2濃度已從前期實驗結(jié)果中篩選出來，選取0～72 h為H2O2處理時間，MTT測其存活率。結(jié)果顯示細(xì)胞生存率隨著時間的增加而下降，在24 h時，其生存率50.95%最接近細(xì)胞IC50，最終選擇24 h為本實驗H2O2處理時間。

蕓香苷可從蕎麥花、紅茶、蘋果、蕓香葉等植物中提取出來，清除氧自由基、減少脂質(zhì)過氧化物的生成，發(fā)揮抗氧化作用［9－10］。前期實驗［11］已證實蕓香苷對H2O2誘導(dǎo)的HLEC凋亡有保護作用，且其濃度也從前期實驗結(jié)果中篩選出來。筆者選取30 min～4 h為其預(yù)處理時間，MTT測其存活率。結(jié)果顯示，蕓香苷在預(yù)處理1 h時，細(xì)胞存活率最高，隨后細(xì)胞生存率與時間呈負(fù)相關(guān)，因此最終選擇1 h為本實驗蕓香苷預(yù)處理時間。

PI3K是參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號分子之一。AKT（又名蛋白激酶B，PKB）是原癌基因CAKT的表達產(chǎn)物。PI3K可調(diào)控AKT的激活，磷酸化的AKT進一步激活或者抑制下游靶蛋白，參于細(xì)胞增殖、遷移、存活及新陳代謝等多種生理活動［12］。因其具有抗凋亡作用，在臨床疾病機制中越來越備受關(guān)注。Wang et al［13］研究表明，PI3K／AKT信號通路與腫瘤細(xì)胞的增殖有關(guān)；研究［14］表明PI3K／AKT信號通路參與LEC的增殖、遷移，與后發(fā)障的形成有關(guān)。而特異性抑制劑LY294002可阻斷PI3K／AKT途徑活化，抑制其抗凋亡作用。

本實驗首次在體外H2O2誘導(dǎo)HLEC凋亡模型中加入抗氧化劑蕓香苷，試圖探討PI3K／AKT信號通路在蕓香苷抑制H2O2誘導(dǎo)的HLEC凋亡中的作用。流式細(xì)胞術(shù)及Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，H2O2能引起細(xì)胞凋亡，降低p-AKT的相對表達量；蕓香苷能逆轉(zhuǎn)H2O2引起的氧化損傷，同時p-AKT高表達，但在蕓香苷處理細(xì)胞之前加入PI3K／AKT信號通路阻斷劑LY294002后，AKT磷酸化被抑制，細(xì)胞凋亡率再次升高，且與H2O2組無明顯差異。

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Rutin inhibits hydrogen peroxide-induced apoptosis through PI3K／AKT signaling pathway in human lens epithelial cells

Guo Bin，Zhou Yanfeng
（Dept of Ophthalmology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

Objective To explore whether PI3K／AKT signaling pathway participates in the inhibiting effectof Rutin on H2O2-induced apoptosis in human lens epithelial cells（HLEC）.MethodsHLEC were divided into four groups：control group，H2O2group，rutin group，LY294002 group.Cell survival rateswere determined by a 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）assay；cell apoptosis rates weremonitored by flow cytometry with Annexin V-FITC and propidiun iodide（PI）staining.Western blot was used tomeasure the expression levels of AKT and p-AKT.ResultsH2O2induced HLEC apoptosis.Compared with H2O2group，rutin group not only increased the expression lever of p-AKT，but also reduced cell apoptosis rate（P＜0.01）.In LY294002 group，LY294002，an inhibitor of PI3K／AKT signaling pathway，could significantly block the change of these indexes produced by rutin group（P＜0.01），butno significant change compared with H2O2group.ConclusionRutin inhibits H2O2-induced cell apoptosis and may be associated with PI3K／AKT signaling pathway.

rutin；human lens epithelial cells；PI3K／AKT signaling pathway；hydrogen peroxide；cell apoptosis

R 776.1

A

1000－1492（2015）08－1107－04

2015－03－13接收

安徽省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計劃課題（編號：2012zy50）作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，合肥 230022

郭 彬，女，碩士研究生；

周艷峰，女，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：Lizzhou＠163.com