褪黑素抑制酒精性脂肪肝發(fā)展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

胡奇珍，洪汝濤，高學(xué)梅

褪黑素抑制酒精性脂肪肝發(fā)展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

胡奇珍，洪汝濤，高學(xué)梅

目的利用酒精性脂肪肝大鼠模型，探討褪黑素對(duì)酒精性脂肪肝的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制。方法42只SD雌性大鼠隨機(jī)分成4組：模型組12只，正常組、褪黑素低劑量組和褪黑素高劑量組各10只，用酒精灌胃法，持續(xù)8周制造出大鼠酒精性脂肪肝模型。褪黑素組大鼠在酒精灌胃后腹腔注射褪黑素。8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，HE染色觀察大鼠肝臟病理改變，免疫組化法檢測(cè)肝組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的表達(dá)。生化法檢測(cè)各組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、膽紅素（TBIL）的水平以及大鼠肝勻漿中丙二醛（MDA）的水平和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的活性。結(jié)果與正常組比較，模型組肝細(xì)胞可見較多的炎性細(xì)胞浸潤，脂肪變性明顯，大量脂肪空泡出現(xiàn)，而褪黑素各組大鼠肝組織病理變化程度均較模型組減輕。與正常組比較，模型組大鼠血清中肝生化指標(biāo)（ALT、AST和TBIL）水平明顯升高（P＜0.01），肝勻漿中MDA含量明顯升高（P＜0.01），GPx活性明顯降低（P＜0.01），而褪黑素低、高劑量組大鼠肝生化水平較模型組顯著降低（P＜0.05），肝勻漿MDA含量較模型組顯著降低（P＜0.01），GPx活性較模型組明顯升高（P＜0.01）。并且褪黑素能降低大鼠肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論褪黑素可能抑制大鼠酒精性脂肪肝的發(fā)展，具體機(jī)制與其抵抗氧化應(yīng)激作用和抑制肝組織中TNF-α和IL-6等相關(guān)因子的表達(dá)有關(guān)。

褪黑素；酒精性脂肪肝；腫瘤壞死因子α；白介素-6

長期大量飲酒可導(dǎo)致肝臟疾病，但酒精對(duì)肝臟造成損害的機(jī)制尚未完全闡明。酒精的主要代謝器官是肝臟，在肝臟的主要代謝途徑是通過肝內(nèi)的微粒體乙醇氧化系統(tǒng)（microsomal ethanol oxidizing system，MEOS）、乙醇脫氫酶系統(tǒng)（alcoholdehydrogenase，ADH）和過氧化氫酶系統(tǒng)代謝［1］。在MEOS途徑中，乙醇產(chǎn)生的大量活性氧可造成肝臟損害，在其他途徑中，乙醇代謝產(chǎn)生的大量乙醛也對(duì)肝臟有損害作用，因?yàn)橐胰┦歉叨确磻?yīng)活性分子，能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成乙醛－蛋白加合物，該分子對(duì)肝細(xì)胞有直接損傷作用。另外，酒精代謝過程中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，集聚大量氧化產(chǎn)物、脂質(zhì)過氧化分子、氧自由基、內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等有害物質(zhì)，可進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞代謝紊亂、Kupffer細(xì)胞功能低下，從而導(dǎo)致酒精性脂肪肝發(fā)生［2］。褪黑素是一種生物活性物質(zhì)，由松果體分泌，是一種自由基清除因子，有抗氧化作用，同時(shí)可以誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，而這些抗氧化酶在保護(hù)肝臟免受酒精損害中發(fā)揮重要作用［3］。故可以推測(cè)褪黑素在酒精性肝病的發(fā)病過程中，對(duì)肝臟可能存在保護(hù)作用，而該研究旨在探討褪黑素對(duì)酒精性脂肪肝的保護(hù)作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雌性普通級(jí)SD大鼠，180～300 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下，給予正常飲食，適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

1.2 試劑與儀器瑞士Roche Modular DPP全自動(dòng)生化分析儀（瑞士羅氏公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（美國Sigma公司）；DT600K分析天平（北京友儀四方科技發(fā)展有限公司）；752N分光光度計(jì)（上海綠宇生物科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本NIKON公司）；褪黑素（美國Sigma公司）；免疫組化試劑盒、DAB染色液、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）檢測(cè)試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）兔抗鼠多克隆抗體、白介素-6（interleukin-6，IL-6）兔抗鼠多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 造模及動(dòng)物處理大鼠分組如下：正常組（10只）、模型組（12只）、褪黑素低劑量組（10只）、褪黑素高劑量組（10只），模型組和褪黑素組大鼠的酒精攝入量為8 g／（kg·d），酒精體積比為40%（v／v），考慮到大鼠胃內(nèi)容量體積局限，每天灌胃2次，中間間隔8 h，共造模8周。在第2次酒精灌胃后1 h，給予褪黑素低劑量組和高劑量組老鼠腹腔注射褪黑素10、20 mg／kg至8周末。實(shí)驗(yàn)最后，大鼠腹主動(dòng)脈取的血標(biāo)本，離心后獲得血清標(biāo)本。取新鮮肝臟組織，獲得肝臟標(biāo)本。

1.4 大鼠血清生化、MDA和GPx活性檢測(cè)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定大鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alaninetransarninase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、膽紅素（total bilirubin，TBIL）的水平。按照試劑盒說明書步驟，制備新鮮肝臟組織勻漿液，生理鹽水稀釋，離心，取上清液，進(jìn)行蛋白定量，再用分光光度法得光密度值（optical density，OD），計(jì)算出MDA含量和GPx活性。

1.5 病理檢測(cè)方法取肝臟左葉部分組織，在10%的甲醛中固定至少24 h，石蠟包埋，再切至5 μm厚組織薄片，HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)改變。對(duì)切片按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)評(píng)估：0級(jí)（正常肝細(xì)胞），1級(jí)（＜1／4肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性），2級(jí)（1／4～1／2肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性），3級(jí)（1／2～3／4肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性），4級(jí)（＞3／4肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性）［4］。

1.6 TNF-α和IL-6的免疫組化檢測(cè)及陽性細(xì)胞嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作步驟，標(biāo)本切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)，再滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉孵化后，滴加一抗，在4℃環(huán)境下孵育過夜，次日加入二抗，然后DAB染色，分別設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，陰性對(duì)照一抗改用PBS液替代，最后鏡下攝片分析結(jié)果。TNF-α和IL-6陽性均表達(dá)在肝細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，免疫組化染色后胞質(zhì)內(nèi)可見較強(qiáng)的棕黃色陽性反應(yīng)顆粒。每張切片在電子顯微鏡（× 400）下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，再用Image-Pro Plus影像分析器進(jìn)行圖像分析，獲得定量資料，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較采用LSD方法檢驗(yàn)。等級(jí)資料（病理分級(jí)）采用Ridit分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理學(xué)改變Ridit分析總體等級(jí)資料，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。正常組大鼠肝臟病理可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞無壞死、炎癥，無纖維化等明顯病理改變。模型組大鼠肝臟鏡下可見明顯脂肪空泡，一些細(xì)胞腫脹變形，匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉界限模糊。與模型組比較，褪黑素組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)鏡下顯示肝細(xì)胞腫脹明顯減輕，脂肪變性炎性細(xì)胞浸潤程度明顯降低，肝組織總體病理變化程度明顯減輕。見圖1。

2.2 大鼠血清肝功能檢測(cè)結(jié)果方差分析結(jié)果顯示大鼠血清ALT、AST、TBIL差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝9.54、5.58、11.24，P＜0.05），與正常組相比，模型組大鼠血清ALT、AST和TBIL明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，褪黑素組大鼠肝功能水平有所降低（P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠肝勻漿MDA水平及GPx活性的檢測(cè)結(jié)果方差分析結(jié)果顯示，各組MDA含量及GPx活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝24.42、16.37，P＜0.05），與正常組比較，模型組大鼠肝勻漿MDA水平顯著升高（P＜0.01），GPx活性顯著下降（P＜0.01）。各劑量褪黑素能顯著降低酒精性脂肪肝模型大鼠肝勻漿中MDA水平（P＜0.01），可升高肝勻漿中GPx活性（P＜0.05）。見表2。

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平）

表1 各組大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平）

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項(xiàng)目正常組（n＝7）模型組（n＝8）褪黑素低劑量組（n＝7）褪黑素高劑量組（n＝6）ALT（U／L）35.14±4.95 44.00±4.60**38.43±3.26＃38.07±4.50＃AST（U／L）91.86±11.77 118.62±10.07**105.29±9.71＃103.83±5.56＃TBIL（U／mg prot）0.37±0.09 0.59±0.08**0.48±0.10＃0.46±0.10＃

表2 各組大鼠肝勻漿中MDA、GPx的水平）

表2 各組大鼠肝勻漿中MDA、GPx的水平）

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項(xiàng)目正常組（n＝7）模型組（n＝8）褪黑素低劑量組（n＝7）褪黑素高劑量組（n＝6）MDA（nmol／mg prot）1.47±0.32 2.29±0.40**1.70±0.43＃＃1.50±0.25＃＃GPx（nmol／mg prot）50.46±2.97 34.71±3.80**38.91±4.20＃41.52±6.87＃＃

表3 各組大鼠肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)

表3 各組大鼠肝組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：＃P＜0.05，＃＃P＜0.01

項(xiàng)目正常組（n＝7）模型組（n＝8）褪黑素低劑量組（n＝7）褪黑素高劑量組（n＝6）TNF-α0.343±0.041 0.545±0.049**0.456±0.036＃＃0.398±0.025＃＃IL-6 0.404±0.055 0.640±0.056**0.567±0.053＃0.488±0.048＃＃

2.4 免疫組化檢測(cè)TNF-α和IL-6的表達(dá)方差分析結(jié)果顯示，TNF-α和IL-6表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝46.18、29.36，P＜0.05），光鏡下可見正常組大鼠肝臟組織TNF-α和IL-6有微量表達(dá)，僅表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中可見淡黃色顆粒。而模型組有抗原的明顯表達(dá)（P＜0.01），TNF-α和IL-6表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)清晰的顆粒狀棕黃色物質(zhì)。與模型組相比，褪黑素能顯著降低TNF-α和IL-6的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。見表3、圖2、3。

3 討論

酒精性脂肪肝是酒精性肝病的早期階段，其脂肪代謝已受到影響，肝臟組織中可出現(xiàn)空泡脂肪變性，可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化［5］。本研究模型組大鼠肝臟病理觀察到典型的酒精性脂肪肝改變?nèi)缰咀冃?、炎性?xì)胞浸潤等，說明此次造模成功，為下一步實(shí)驗(yàn)提供良好基礎(chǔ)。另外，本實(shí)驗(yàn)顯示，褪黑素能不同程度減輕大鼠肝臟病理學(xué)改變，降低酒精性脂肪肝大鼠血清ALT、AST活性和TBIL水平，以及大鼠肝組織中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，說明褪黑素對(duì)酒精性脂肪肝有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激在酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可引起脂質(zhì)的過氧化和細(xì)胞膜損傷，產(chǎn)生大量活性氧，與酒精代謝產(chǎn)生的內(nèi)毒素一起刺激激活肝臟Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎因子和免疫調(diào)節(jié)因子，如核轉(zhuǎn)錄因子κB（unclear transcription factor-κB，NF-κB）、前列腺素E2和TNF-α，TNF-α可誘發(fā)肝細(xì)胞發(fā)生壞死和凋亡［6］，并引起線粒體功能障礙，刺激過氧化物及其他炎性因子發(fā)揮作用，造成肝臟損害［7－8］。NF-κB和TNF-α可反過來刺激肝臟Kupffer細(xì)胞釋放大量細(xì)胞IL-6、IL-8等炎癥因子，與TNF-α等一起參與肝細(xì)胞的變性、壞死［9］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠肝臟TNF-α和IL-6的表達(dá)較正常組大鼠明顯增強(qiáng)，該結(jié)果與相關(guān)報(bào)道符合，認(rèn)為酒精性脂肪肝的發(fā)生與TNF-α的過度表達(dá)以及相關(guān)炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子大量釋放有密切關(guān)系。

褪黑素的分泌受到晝夜節(jié)律的調(diào)節(jié)，在很多生物損傷模型中，表現(xiàn)出強(qiáng)大的器官保護(hù)作用。褪黑素作為一種自由基清除劑，能清除大量活性氧，并具有提高抗氧化酶的作用［3，10］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)描述了褪黑素在缺血再灌注肝損傷和免疫性肝損傷大鼠模型中顯現(xiàn)了肝臟保護(hù)作用，大鼠轉(zhuǎn)氨酶水平和自由基清除能力的變化均通過實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)［11－12］。但褪黑素與慢性酒精損害相關(guān)的研究報(bào)道不多。在本次酒精性肝損傷實(shí)驗(yàn)中，褪黑素有效的提高抗氧化酶GPx的活性，能明顯降低作為衡量脂質(zhì)過氧化程度的MDA水平。同時(shí)褪黑素組大鼠肝臟TNF-α和IL-6的表達(dá)較模型組減少，認(rèn)為褪黑素能有效抑制酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展，并且提示褪黑素防治酒精性脂肪肝的作用機(jī)制之一與降低TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)。

［1］ Zima T，Kalousova M.Oxidative stress and signal transduction pathways in alcoholic liver disease［J］.Alcohol Clin Exp Res，2005，29（11 Suppl）：110S－5S.

［2］ Beier JI，McClain C J.Mechanisms and cell signaling in alcoholic liver disease［J］.Biological chemistry，2010，391（11）：1249－64.

［3］ Allegra M，Reiter R J，Tan D X，etal.The chemistry ofmelatonin＇s interaction with reactive species［J］.Pineal Res，2003，34（1）：1－10.

［4］ Nanji A，Jokelainen K，Tipoe G，et al.Curcumin prevents alcohol-induced liver disease in rats by inhibiting the expression of NF-κB dependent genes［J］.Physiol Gastrointest Liver Physiol，2003，284（2）：G321－7.

［5］ Hoek JB，Pastorino J.Cellular signalingmechanisms in alcoholinduced liver damage［J］.Semin Liver Dis，2004，24（3）：257－72.

［6］ O＇Shea R S，Dasarathy S，McCullough A J.Alcoholic liver disease［J］.Hepatology，2010，51（1）：307－28.

［7］ 金武丕，孟繁平，權(quán)修權(quán)，等.酒精性肝病細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17（23）：2871－4.

［8］ 莫成林.細(xì)胞因子在酒精性肝炎中的作用［J］.國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，2003，30（3）：171－5.

［9］ Tiberio G A，Tiberi L，Benentti A，et al.Interleukin-6 sustains hepatic regeneration in cirrhoticra［J］.Hepatogastroenterolog，2007，54（75）：873－83.

［10］Tomás-Zapico C，Coto-Montes A.Melatonin as antioxidant under pathological processes［J］.Recent Pat Endocr Metab Immune Drug Discov，2007，1（1）：63－82.

［11］王 華，沈玉先，魏 偉，等.褪黑素對(duì)免疫性肝損傷小鼠自由基和細(xì)胞因子的影響［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2002，18（3）：331－4.

［12］甄允方，孫麻林，顧志成，等.褪黑素對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（1）：41－2.

Animal studies ofmelatonin suppression alcoholic fatty liver development

Hu Qizhen，Hong Rutao，Gao Xuemei
（Dept of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Key Laboratory of Disease of Anhui Province，Hefei 230022）

Objective To investigate the protective effects ofmelatonin and possiblemechanisms on ratswith alcoholic fatty liver（AFL）.MethodsAll rats were randomly divided into 4 groups：normal group（n＝10），model group（n＝12）and melatonin groups（10 mg／kg，20 mg／kg；n＝10，respectively）.Themodel of rats’alcoholic fatty liver was induced by intragastric influsion of ethanol for 8 weeks.Themelatonin groups’rats received melatonin by intraperitoneal injection after intragastric infusion of ethanol.Histopathological changes were evaluated by hematoxylin and eosin staining.The expressions of tumor necrosis factor-α（TNF-α）and interleukin-6（IL-6）were detected by immunohistochemicalmethods.The detection of aspartate aminotransferase（AST）levels and alanine transarninase（ALT）levels and the total bilirubin（TBIL）levels in serum were provided by routine laboratory methods using an autoanalyzer.The levels of malondialdehyde（MDA）and activities of glutathione peroxidase（GPx）weremeasured by spectrophotometry.ResultsCompared with the normal group，the liver cellsof themodel group showed obvious steatosis and significant swelling.However，less degree and less extensive of steatosis and swelling were observed in the melatonin groups.Compared with the normal group，the levels of ALT，AST and TBIL in serum and the levels of MDA in liver homogenates were significantly increased in themodel group（P＜0.01），and the activities of GPx were distinctly decreased in the model group（P＜0.01）.But in the melatonin groups，the levels of ALT，AST and TBIL in serum and the levels ofMDA in liver homogenateswere decreased（P＜0.01），and the activities of GPx were increased（P＜0.01）.Additionally，melatonin lessened the expression of TNF-αand IL-6 in liver obviously（P＜0.01）.ConclusionMelatonin may inhibit the development of alcoholic fatty liver and its possiblemechanism is the ability to resist oxidative stress and lessen the expression of TNF-αand IL-6 and other relevant factors in liver.

melatonin；alcoholic fatty liver；necrosis factor-α；interleukin-6

R 575.1

A

1000－1492（2015）08－1115－04

2015－04－24接收

安徽省年度科研計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：10020503084）

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化疾病重

點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230032

胡奇珍，女，碩士研究生；

洪汝濤，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hongrutaoah＠aliyun.com