感染性眼內(nèi)炎患者玻璃體液中壞死性凋亡相關(guān)蛋白MCP-1的檢測

董 凱，韓林峰，劉靜雯，吳章友，孫思勤，柯根杰

感染性眼內(nèi)炎患者玻璃體液中壞死性凋亡相關(guān)蛋白MCP-1的檢測

董 凱，韓林峰，劉靜雯，吳章友，孫思勤，柯根杰

目的探討感染性眼內(nèi)炎患者玻璃體液中壞死性凋亡相關(guān)蛋白MCP-1的表達(dá)及其與視力預(yù)后的關(guān)系，為預(yù)測疾病預(yù)后及進(jìn)一步的眼內(nèi)藥物干預(yù)，保護(hù)視功能提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法收集17例感染性眼內(nèi)炎患者的玻璃體液，檢測壞死性凋亡相關(guān)蛋白單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的表達(dá)，分析臨床治療效果。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組感染性眼內(nèi)炎患者玻璃體液中MCP-1的濃度顯著高于對照組MCP-1的濃度（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組的MCP-1濃度與最佳矯正視力呈負(fù)相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論感染性眼內(nèi)炎患者眼內(nèi)有壞死性凋亡的發(fā)生，與患者視功能損害有關(guān)，這為進(jìn)一步干預(yù)壞死性凋亡，保護(hù)患者視功能提供了依據(jù)。

眼內(nèi)炎；壞死性凋亡；單核細(xì)胞趨化蛋白1

感染性眼內(nèi)炎是較為常見的一種眼科急癥，多發(fā)生于眼科手術(shù)后和眼外傷的患者，盡管手術(shù)可以抑制炎癥反應(yīng)，挽救眼球，但是多數(shù)患者由于炎癥的迅速播散，視細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致視功能不可逆的損害，術(shù)后視功能的恢復(fù)并不理想。另一方面，近年來研究［1］顯示，壞死性凋亡也是一種基本細(xì)胞死亡形式，常常發(fā)生于組織炎癥、缺血缺氧等應(yīng)激環(huán)境，單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）是導(dǎo)致壞死性凋亡發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白。據(jù)此推測，在感染性眼內(nèi)炎患者中，壞死性凋亡也參與了其病理過程，部分導(dǎo)致了視功能的損傷。所以，該研究收集了17例感染性眼內(nèi)炎患者的玻璃體液，檢測壞死性凋亡相關(guān)蛋白MCP-1的表達(dá)情況，探討壞死性凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白在感染性眼內(nèi)炎患者病理過程中的致病作用，為預(yù)測疾病預(yù)后及進(jìn)一步的眼內(nèi)藥物干預(yù)，提高感染性眼內(nèi)炎患者視功能恢復(fù)提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2013年1月～2014年6月收治的17例（17只眼）感染性眼內(nèi)炎患者作為實(shí)驗(yàn)組，其中男12例（12只眼），女5例（5只眼）；年齡29～85（54.35±17.45）歲；右眼8只，左眼9只；有眼外傷病史者10例（10只眼），合并有內(nèi)眼手術(shù)史者7例（7只眼）；入院前最佳矯正視力無光感2只眼，光感7只眼，手動(dòng)6只眼，0.08者1只眼，0.4者1只眼。另外收集特發(fā)性黃斑裂孔或黃斑前膜的6例（6只眼）患者作為對照組，其中特發(fā)性黃斑裂孔4例4只眼，黃斑前膜患者2例2只眼，男性患者1例1只眼，女性患者5例5只眼，年齡54～65（61.67±4.08）歲。所有感染性眼內(nèi)炎患者主要診斷標(biāo)準(zhǔn)包括：眼痛伴視力漸進(jìn)性下降、有眼外傷或內(nèi)眼手術(shù)病史；結(jié)膜充血、水腫，角膜水腫或潰瘍，或伴有前房積膿，裂隙燈檢查見玻璃體白色或黃白色混濁，B超檢查提示玻璃體混濁［2－3］。患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方案如果患者臨床表現(xiàn)為較為明顯的前房積膿，但是不伴有明顯的玻璃體混濁，則給予萬古霉素前房沖洗或玻璃體腔注射；如果患者表現(xiàn)為明顯的前房積膿，而且同時(shí)合并有明顯的玻璃體腔混濁，則采用玻璃體切除聯(lián)合視網(wǎng)膜手術(shù)，同時(shí)行萬古霉素玻璃體腔灌洗和注射。以上治療方案中萬古霉素玻璃體腔注射量為1 mg，灌注液濃度為0.02 g／L［3］。

1.3 標(biāo)本采集患者在行玻璃體腔穿刺注藥前，將2 ml注射器連接6號(hào)針頭于角膜緣后4 mm穿刺玻璃體腔，抽取玻璃體液（0.1～0.2 ml）待檢；對于擬行玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)的患者，術(shù)前取玻璃體標(biāo)本時(shí)，將玻璃體切割頭回流管處連接無菌注射器，盡可能多的收集切除的混濁玻璃體，取0.2～0.4 ml存入－80℃冰箱待檢。術(shù)后納入研究的患者按照常規(guī)眼內(nèi)炎患者治療方案進(jìn)行后續(xù)治療，主要觀察視力和眼內(nèi)炎癥是否得到控制［3］。

1.4 標(biāo)本檢測室溫下解凍標(biāo)本，采用ELISA法檢測，步驟如下：采用MCP-1酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海通蔚實(shí)業(yè)有限公司），分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50 μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl，輕輕晃動(dòng)混勻；37℃溫育30 min；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次；加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外；再次溫育和洗滌；每孔先加入顯色劑A、B各50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)；450 nm波長依序測量各孔的吸光度（optical density，OD）值，通過OD值計(jì)算得到樣本中MCP-1蛋白的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)用±s表示，實(shí)驗(yàn)組和對照組間MCP-1濃度采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組中術(shù)后最佳視力與MCP-1濃度的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果納入研究的17例感染性眼內(nèi)炎患者直接行玻璃體視網(wǎng)膜聯(lián)合手術(shù)者12例（12只眼），其中硅油填充者8例（8只眼），感染未得到控制而進(jìn)一步行眼內(nèi)容剜除術(shù)者1例（1只眼）；直接行前房沖洗／玻璃體腔注藥術(shù)者5例（5只眼），其中感染未得到控制而進(jìn)一步行玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)者3例（3只眼），再次手術(shù)后感染均得到控制。增菌培養(yǎng)陽性者4例（4只眼），陽性率為23.52%，分別是表皮葡萄球菌2例，草綠色鏈球菌1例，肺炎鏈球菌1例。

2.2 MCP-1濃度實(shí)驗(yàn)組感染性眼內(nèi)炎患者玻璃體液中MCP-1的濃度為（1 867.82±332.67）mg／L，對照組中MCP-1的濃為（238.66±30.60）mg／L，實(shí)驗(yàn)組濃度顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝19.95，P＜0.05）。

2.3 術(shù)后最佳矯正視力和MCP-1濃度的關(guān)系所有實(shí)驗(yàn)組患者術(shù)后隨訪3～6個(gè)月不等，最終最佳矯正視力分布為（5分制）：無光感1例，1.0（光感）2例，2.0（眼前手動(dòng)）6例，3.0（眼前指數(shù)）2例，3.9分1例，4.0分1例，4.3分1例，4.4分2例，4.7分 1例。術(shù)后最佳矯正視力與MCP-1濃度呈負(fù)相關(guān)性（r＝－0.95，P＜0.05）。見圖1。

3 討論

視細(xì)胞的死亡方式主要有凋亡、壞死和自噬性細(xì)胞死亡［4］。壞死性凋亡是程序性細(xì)胞壞死，本課題前期研究［5］顯示在視網(wǎng)膜脫離中有光感受器細(xì)胞的壞死性凋亡存在，可以被壞死性凋亡特異性抑制劑necrostatin-1抑制［6］。感染性眼內(nèi)炎同樣存在組織的缺血缺氧，所以本課題通過檢測壞死性凋亡通路上重要標(biāo)記蛋白MCP-1，首次證實(shí)了在感染性眼內(nèi)炎患者中同樣存在有壞死性凋亡的發(fā)生，且MCP-1蛋白的表達(dá)與患者的最終視功能呈負(fù)相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對預(yù)測該類患者的預(yù)后，進(jìn)一步干預(yù)壞死性凋亡，提高感染性眼內(nèi)炎患者視功能的恢復(fù)具有臨床指導(dǎo)意義。

感染性眼內(nèi)炎主要的治療方案包括前房沖洗、玻璃體腔注藥和玻璃體視網(wǎng)膜聯(lián)合手術(shù)［7］。本研究中，如果患者僅表現(xiàn)為前房積膿，玻璃體腔無明顯混濁或少許混濁，則行前房沖洗／玻璃體腔注藥術(shù)；如果玻璃體腔混濁明顯，甚至懷疑有視網(wǎng)膜脫離，則直接行玻璃體視網(wǎng)膜聯(lián)合手術(shù)。本研究中采用萬古霉素行前房沖洗／玻璃體腔注藥術(shù)共5例，2例患者的眼內(nèi)感染得到控制，3例患者炎癥加重，進(jìn)一步行玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)。玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)可以直接清除化膿的玻璃體和病原體，從而迅速控制炎癥［7］，本研究中共有12例患者直接行玻璃體視網(wǎng)膜手術(shù)，除1例患者感染仍然得不到控制而行眼內(nèi)容剜除外，其余患者眼內(nèi)炎癥得到控制，隨訪期間無炎癥復(fù)發(fā)。有研究者報(bào)道66例行玻璃體視網(wǎng)膜聯(lián)合手術(shù)的感染性眼內(nèi)炎患者，手術(shù)后眼內(nèi)炎癥均得到控制，在隨訪期間未觀察到眼內(nèi)炎癥復(fù)發(fā)［8］。所以，玻璃體腔注藥和玻璃體視網(wǎng)膜聯(lián)合手術(shù)可以有效地抑制感染性眼內(nèi)炎。

盡管感染性眼內(nèi)炎患者通過有效的治療后，炎癥得到控制，但是患者的視功能往往恢復(fù)不理想，有研究者報(bào)道46例感染性眼內(nèi)炎患者，經(jīng)過玻璃體腔注藥或玻璃體視網(wǎng)膜聯(lián)合手術(shù)后，僅有6例患者最終最佳矯正視力在0.2以上［2］，說明感染性眼內(nèi)炎患者存在有視網(wǎng)膜組織尤其是光感受器細(xì)胞的不可逆損傷，盡管術(shù)后炎癥得到控制，但是視網(wǎng)膜各層組織的功能未得到充分的保護(hù)，從而導(dǎo)致了這部分患者視功能恢復(fù)不理想。如何保護(hù)感染性眼內(nèi)炎患者的視功能是目前研究的重點(diǎn)。

壞死性凋亡的發(fā)生與組織缺血缺氧和炎癥刺激密切相關(guān)［9］。其信號(hào)通路中受體間作用蛋白1（RIP1）和受體間作用蛋白3（RIP3），相互激活并且磷酸化后，導(dǎo)致壞死性凋亡的發(fā)生［10］。新近的研究［1］表明，RIP1和RIP3之間可以通過MCP-1蛋白聯(lián)系，從而通過趨化單核巨噬細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生。所以，本研究選用MCP-1作為檢測靶蛋白，結(jié)果顯示感染性眼內(nèi)炎患者的玻璃體液中MCP-1濃度明顯增加，提示眼內(nèi)有壞死性凋亡的發(fā)生；MCP-1濃度與患者最終視功能的恢復(fù)呈負(fù)相關(guān)，提示隨著組織壞死增加，視功能恢復(fù)愈加不理想。

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Vitreous levels of necroptosis related protein MCP-1 in endophthalm itis

Dong Kai，Han Linfeng，Liu Jingwen，et al
（Dept of Ophthalmology，The Affiliated Provincial Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230001）

Objective To investigate the vitreous level of necroptosis related proteinmonocyte chemotactic protein-1（MCP-1）in endophthalmitis patients，and to provide the proof for visual prognosisand further intraocular drug intervention.MethodsThe study included 17 endophthalmitis cases from January 2013 to June 2014 and the vitreous level of MCP-1 was detected by Elisa test.ResultsThe vitreous humor concentration of MCP-1 in experimental group was significantly higher than that of the control group（P＜0.05）；MCP-1 concentration in experimental group was negatively correlated with the best corrected visual acuity（P＜0.05）.ConclusionNecroptosis occurs in endophthalmitis，which contributes to visual impairment.The study results provide the proof for visual prognosis and further intraocular drug intervention in endophthalmitis patients.

endophthalmitis；necroptosis；MCP-1

R 776.4

A

1000－1492（2015）08－1133－03

2015－05－08接收

安徽省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（編號(hào)：AHNSF 1408085QH159）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81400407）

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院眼科，合肥 230001

董 凱，男，主治醫(yī)師，責(zé)任作者，E-mail：happysubmission＠163.com