Nav1.6在口腔頜面部鱗狀細胞癌組織中的表達

向 娟，蔡伯慧，王 潤，蔣勇

Nav1.6在口腔頜面部鱗狀細胞癌組織中的表達

向 娟，蔡伯慧，王 潤，蔣勇

目的探討Nav1.6在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達，以及Nav1.6在口腔鱗狀細胞癌發生中的相關性。方法采用免疫組化SP法、熒光定量PCR法，對50例口腔鱗癌組織及16例非癌癥組織中Nav1.6表達進行檢測，利用儀器對結果進行分析。結果口腔鱗癌組織中Nav1.6的表達量高于非癌癥組織。隨著分化程度的增高，Nav1.6的表達量逐漸減少。其表達量與患者年齡、性別、腫瘤部位、有無淋巴結轉移無關。結論Nav1.6的上調可能與口腔鱗癌的生物學行為有關，其作用機制有待進一步研究。

口腔鱗狀細胞癌；電壓門控型鈉離子通道；Nav1.6

口腔頜面部的惡性腫瘤中絕大多數為鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），占80%以上［1］。OSCC發病率正逐年上升，對患者生命構成了嚴重威脅［2］，其晚期轉移和復發是口腔頜面外科臨床醫師不得不面對的一個棘手問題。多年來研究人員一直對OSCC的轉移機制進行探討，但至今尚無一種特異并敏感的腫瘤標志物能準確診斷早期腫瘤并確定其惡性程度。電壓門控型鈉離子通道（voltage-gated sodium channel，VGSC）為多亞基的跨膜糖蛋白，由一個α亞單位和β亞單位組成。α亞單位是鈉通道的功能性亞單位［3］，由Nav1.1-Nav1.9共9個亞型組成，分布于不同的組織、細胞［4］。VGSC在“非興奮”細胞（內皮細胞、骨細胞等）和一些癌癥細胞（乳腺癌、卵巢癌等）中表達，涉及癌癥細胞的遷移和侵襲［5］。VGSC中Nav1.6亞型與其他鈉離子通道亞型相比，其表達的癌癥種類最多，而且在每種癌癥中其表達量也最高。這已經在人類宮頸癌、前列腺癌［6－10］等癌癥中得到證實，并且Nav1.6通道的表達或點活動可顯著影響腫瘤細胞的增殖和侵襲能力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本收集和處理 于安徽醫科大學第一附屬醫院口腔頜面外科病房收集50例OSCC患者術中切除的癌癥組織，被收集的病例要求僅患有口腔頜面部鱗狀細胞癌，未曾患有其他癌癥或疾病等。收集的所有標本術后病理診斷為鱗狀細胞癌。患者年齡40～70（60.21±5.11）歲，男30例，女20例。高分化15例，中分化19例，低分化16例。舌癌21例，頰黏膜癌18例、牙齦癌等11例。另收集非癌癥組織16例，如來自拔牙患者術中切除的牙齦組織、唾液腺囊腫等術中切除的非癌癥組織。以上組織收集后均立即凍存于－80℃冰箱。

1.1.2 主要試劑與儀器 兔抗人SCN8A（Nav1.6）多克隆抗體（北京博奧森生物有限公司）；SP試劑盒及DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物科技公司）；DL 2 000 DNA Marker（日本TaKaRa公司，批號：B7301A）；TRIzol（美國Invitrogen公司，批號：14105）。CH20BIMF 200顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；K960型PCR儀（杭州晶格科學儀器有限公司）；LX300型低速迷你離心機（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；PIKOREAL 96熒光定量PCR儀（芬蘭Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR法檢測Nav1.6的表達 將收集好的組織取一部分用作熒光定量PCR。根據Nav1.6的基因序列設計并合成引物，上游引物：5′-CTTGGTCATATTGTGGGTTCTTTC-3′，下游引物：5′-TGTGCCTCTTCCTGTTGCTTCTTA-3′，引物長度165 bp。β-actin上游引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，下游引物5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′，引物長度185 bp。利用TRIzol分別提取非癌癥組織和OSCC組織的RNA。分別取3 μg總RNA做逆轉錄反應。逆轉錄后再分別取1μl反應液做為熒光定量的模板。反應條件為：95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、30 s，40個循環。反應結束由系統自動計算定量結果。

1.2.2 免疫組化法檢測Nav1.6的表達 將收集好的組織取另一部分用做免疫組化。用4%甲醛溶液固定組織，石蠟包埋組織，制成蠟塊，做4μm厚連續切片，甲醛溶液浸泡切片溶解石蠟，放入50℃電熱干燥20min，放入梯度酒精中脫水，清水沖洗。再將切片放入檸檬酸鈉溶液中，高溫加熱10min，冷卻10min，再高溫5min，冷卻至室溫。將每張切片拭干多余水分，滴加H2O2，37℃恒溫箱孵育30min；PBS溶液沖洗3遍，滴加一抗，4℃冰箱放置過夜，PBS沖洗后，滴加二抗；PBS沖洗，滴加DAB顯示劑，顯微鏡下觀察，沖洗干凈切片。蘇木精行細胞核染色，沖洗干凈后放入干燥箱干燥。封片后顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組化結果判定 在光鏡下觀察，凡是細胞膜和細胞質出現黃色至棕黃色顆粒為陽性。在200倍視野下，每例切片隨機選取5個不重復、不重疊的視野，采用雙評分定量積分法［11］對非癌癥組織和OSCC組織中陽性細胞百分數和著色強度進行分析。即根據陽性細胞百分數評分：＜5%（0分）；6%～25%（1分）；26%～49%（2分）；50%～74%（3分）；≥74%（4分）。再根據陽性細胞著色強度評分：細胞無染色（0分）；弱染色（1分）；染色清楚（2分）；強染色（3分）。最后，以兩者得分相乘判斷免疫組化的結果，可以分為：陰性（－）：0分；弱陽性（＋）：1～4分；中度陽性（＋＋）：5～8分；強陽性（＋＋＋）：9～12分。為了使統計方便，將弱陽性、中度陽性、強陽性統稱為陽性。

1.3 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，分別進行χ2檢驗。

2 結果

2.1 熒光定量PCR法檢測Nav1.6的表達經過熔解曲線（圖1）測定，得到了特異性的單峰擴增產物，并且解鏈溫度在80℃左右，產物單一，引物特異性較好，無非特異性擴增產物。各個樣本的擴增曲線平行性好，擴增效率基本一致（圖1）。本次實驗使用relativequantificationstudy的方法分析，采用的指標為2－ΔΔCt。非癌癥組織、高分化鱗癌組、中分化鱗癌組、低分化鱗癌組中Nav1.6mRNA平均相對表達量比較差異有統計學意義（P＜0.05）。方差分析后，非癌癥組與高、中、低分化鱗癌組方差分析F值分別為：3.80、3.97、4.89，高分化組與中、低分化組方差分析F值分別為3.50、4.07，中分化組與低分化組F值為3.558。熒光定量PCR結果顯示，非癌癥組織和OSCC組織中Nav1.6的表達量有明顯差異，在OSCC組織中Nav1.6的表達量隨著腫瘤的分化程度增加而降低，見表1。

2.2 免疫組化檢測Nav1.6的表達免疫組化結果顯示，Nav1.6在非癌癥組織和OSCC組織中均有陽性表達，主要位于細胞膜和細胞質，陽性表達為黃色至棕黃色顆粒。對16例非癌癥組織觀察發現，有2例偶有少量Nav1.6表達，呈淡黃色染色，見表2，絕大多數非癌癥組織呈陰性表達，見圖2A。50例OSCC組織中，較強的染色多分布在癌巢、角化珠中。在癌癥大部分間質中呈陰性表達，間質中浸潤的炎性細胞也有少量染色。在這些癌癥組織中，利用上述雙評分定量積分法得出：高分化鱗癌中陽性8例（弱陽性3例、中度陽性5例）。中分化鱗癌中陽性15例（弱陽性4例、中度陽性3例、強陽性8例）。低分化鱗癌中陽性16例（弱陽性5例、中度陽性5例、強陽性6例）。總計得出，在OSCC中，陰性11例，陽性39例。Nav1.6在不同性別（P＝0.443）、不同部位（P＝0.843）的表達情況差異均無統計學意義，淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組之間差異也無統計學意義（P＝0.571），不同分化程度各組之間比較，差異有統計學意義（P＝0.012）。可見Nav1.6在OSCC中的表達與患者的性別、腫瘤部位、有無淋巴結轉移無相關性，與腫瘤的分化程度相關。見表3、圖2。

表1 非癌癥組織和OSCC組織中Nav1.6的表達

表1 非癌癥組織和OSCC組織中Nav1.6的表達

與非癌癥組比較：*P＜0.05；與高分化組比較：＃P＜0.05；與中分化組比較：△P＜0.05

組別n Nav1.6平均相對表達量非癌癥16 1.00±0.14 OSCC高分化15 2.31±0.52*中分化19 4.46±0.58*＃低分化16 8.86±1.63*△

表2 Nav1.6在非癌癥組織和OSCC中的表達

表3 Nav1.6在OSCC中的表達與臨床病例參數之間的關系

3 討論

Nav1.6做為一種細胞形成動作電位過程中重要的組成構件，與多種疾病相關。目前研究［12］證實Nav1.6在各類癌癥中，尤其是宮頸鱗狀細胞癌中的高表達被認為是新型的腫瘤標志物。利用熒光定量PCR法以及免疫組化法等證實了在OSCC中也存在Nav1.6的表達，而且OSCC組織中的表達明顯高于口腔非癌癥組織，提示Nav1.6可能參與了OSCC的發病。Nav1.6由Schaller et al［13］在大鼠的中樞及周邊神經系統中發現，是由SCN8A基因編碼的，編碼1 976個氨基酸。在人類中，基因的染色體定位為12q。Nav1.6在中樞神經系統中廣泛而均勻地表達，僅少數表達于周圍神經系統。研究［6－10］顯示Nav1.6在腫瘤細胞中也有明顯的表達，這些已經在人類宮頸癌、前列腺癌、非小細胞肺癌、惡性黑色素瘤和惡性胸膜間皮瘤中得到證實。但是目前對于VGSC促使癌癥細胞侵襲、轉移的機制仍然不完全清楚。有些學者認為，鈉離子通道影響細胞的增殖途徑可能與通過影響K＋或Ca2＋的通透性或電活動以及作用于細胞生長有關的信號轉導通路有關［14］。

通過熒光定量PCR，可以觀察到在非癌癥組織和OSCC組織中均有Nav1.6的表達。但OSCC組織中的平均相對表達量明顯大于非癌癥組的平均相對表達量，這一結果與Hemandez-Plata et al［15］在宮頸癌中的研究結果一致。提示Nav1.6可能與OSCC的發病有關，并且與OSCC的分化程度呈負相關性。

免疫組化結果進一步顯示，Nav1.6在OSCC組織中陽性表達率明顯高于非癌癥組織。Nav1.6的表達量與OSCC組織分化程度相關。在高分化、中分化、低分化組織中其陽性表達率不同，表達量與分化程度呈負相關性。研究還顯示Nav1.6的表達與患者的性別、腫瘤生長的部位、有無淋巴結轉移等因素無關。這與收集組織標本中患者的個體差異、實驗樣本量較小，以及其他多種相關因素有關。需要擴大樣本量繼續驗證，也需要對患者進行長期跟蹤隨訪，以進一步觀察Nav1.6與OSCC之間的關系。

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Expression of voltage-gated sodium channel Nav1.6 in oral squamous cell carcinom a

Xiang Juan，Cai Bohui，Wang Run，et al
（Dept of Preventive Dentistry，Stomatologic Hospital and College，AnhuiMedical University＆Key Laboratory of Oral DiseasesResearch of Anhui Province，Hefei 230032）

Objective To investigate the expression of Nav1.6 in oral squamous cell carcinoma and the relationship between Nav1.6 and the developmentof oral squamous cell carcinoma.MethodsImmunohistochemistry，real-time quantitative PCR were used to detect the expression of Nav1.6 in carcinoma and normal human oral tissue.The the results were analyzed by using instruments.ResultsThe results revealed that the expression of Nav1.6 in oral squamous cell carcinoma increased significantly in comparison with the normal oral tissue.The higher the degree of tumor differentiation，the less the expression of Nav1.6.And the expression of Nav1.6 had nothing to do with age，sex，the site of tumor and themetastasis of lymph nodes.ConclusionThe up-regulated levelof Nav1.6mRNA in oral squamous cell carcinoma tissue is significantly associated with the pathogenesis of OSCC.

oral squamous cell carcinoma；voltage-gated sodium channel；Nav1.6

R 780.2

A

1000－1492（2015）08－1157－04

2015－04－22接收

安徽省科技廳年度計劃（編號：12070403062）

安徽醫科大學口腔醫學院口腔預防醫學教研室，合肥

230032

向 娟，女，碩士研究生；

蔣 勇，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：j6263＠163.com