非家族性青年三陰性乳腺癌與BRCA1基因突變的關(guān)系

劉曉丹，許文婷，楊 亮，吳 濤，王 斌，吐魯洪·沙吾列，趙 倩，迪力夏提·金斯汗，朱麗萍

非家族性青年三陰性乳腺癌與BRCA1基因突變的關(guān)系

劉曉丹，許文婷，楊 亮，吳 濤，王 斌，吐魯洪·沙吾列，趙 倩，迪力夏提·金斯汗，朱麗萍

目的探討非家族性青年三陰性乳腺癌（TNBC）與BRCA1基因突變的關(guān)系以及突變者與未突變者的臨床病理組織特征的差別。方法應(yīng)用PCR擴(kuò)增聯(lián)合DNA直接測(cè)序法檢測(cè)新疆地區(qū)50例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變情況，同時(shí)對(duì)比分析突變者與未突變者的臨床病理組織特征。結(jié)果①50例非家族性青年TNBC患者BRCA1突變率為26%（13／50），其中漢族高于少數(shù)民族（27.6%vs 23.8%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.599）。②50例非家族性青年TNBC患者中發(fā)現(xiàn)13例BRCA1突變的12個(gè)位點(diǎn)，其中4個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)；2個(gè)BRCA1基因突變“熱點(diǎn)”；③50例非家族性青年TNBC BRCA1突變者與未突變者相比，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高（69.2%vs35.1%），TNM分期晚（77%vs37.8%），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論新疆地區(qū)非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變率高；212＋1G＞T和2077G＞A可能為新疆地區(qū)非家族性青年TNBC患者遺傳易感位點(diǎn)，尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究；突變者與未突變者相比，存在臨床病理組織差異。

BRCA1基因；突變；非家族性；青年女性；三陰性乳腺癌；臨床病理特征

BRCA1基因是重要的抑癌基因，其結(jié)構(gòu)和功能的異常與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)［1］。研究［2］表明，BRCA1基因具有顯性遺傳特性，約45%的家族性乳腺癌中檢測(cè)出BRCA1基因突變。近年來(lái)，隨著乳腺癌發(fā)病率的增加，發(fā)病年齡日趨年輕化，青年乳腺癌在臨床上已不少見(jiàn)。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）因受體均為陰性，治療手段較單一，療效不佳。這類乳腺癌侵襲性高，組織學(xué)分級(jí)較高，局部復(fù)發(fā)和全身轉(zhuǎn)移快，死亡率高［3］。青年TNBC患者預(yù)后較差。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于家族性及青年性乳腺癌已有報(bào)道，但對(duì)于非家族性青年TNBC鮮有報(bào)道，因此主要以新疆地區(qū)非家族性青年TNBC患者（≤40歲）為研究對(duì)象，分析BRCA1突變情況，探討B(tài)RCA1與非家族性青年TNBC的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年4月～2014年1月新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科收治的經(jīng)病理確診、符合TNBC標(biāo)準(zhǔn)的青年女性乳腺癌患者50例，其中漢族29例，少數(shù)民族21例；患者發(fā)病年齡26～40歲，中位發(fā)病年齡34歲。均首次診斷為原發(fā)性乳腺癌，既往無(wú)其他腫瘤史，無(wú)化療、放療史，排除妊娠期、哺乳期乳腺癌。按BRCA1基因突變與否分為BRCA1基因突變組（n＝13）與BRCA1基因未突變組（n＝37），獲得知情同意后抽取外周靜脈血，置入5.0 ml含EDTA-K2抗凝的真空采血管中，放入－80℃冰箱中保存。該研究已獲得新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入組患者均已簽署B(yǎng)RCA1基因檢測(cè)知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑與器材血液基因組DNA提取系統(tǒng)（非離心柱型）、Super Pure dNTPMix、Pfu DNA Polymerase（北京天根公司）；Marker DL2000、6×Loading Buffer（大連TaKaRa公司）；瓊脂糖、50×TAE（上海生工公司）；核酸蛋白定量?jī)x（北京凱奧公司）；臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器制造廠）；電泳儀電源、電泳槽（北京市六一儀器廠）；梯度PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 使用血液基因組DNA提取系統(tǒng)按試劑盒說(shuō)明提取DNA，電泳、保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：dNTPMix（10 mmol／L）0.6μl，10×Pfu Buffer 3μl，Primer F（10 μmol／L）0.6μl，Template 0.6μl，Primer R（10 μmol／L）0.6μl，Pfu DNA Polymerase 0.3μl，ddH2O224.3μl，相對(duì)應(yīng)的DNA為50 ng，總反應(yīng)體系為30 μl。PCR程序：95℃5 min，95℃30 s，退火溫度30 s，72℃60 s，40個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸5 min，4℃保存，引物序列和退火溫度見(jiàn)表1。

1.3.3 直接測(cè)序與分析 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl在2.0%瓊脂糖凝膠電泳為單一亮條帶，取目的片段送至烏魯木齊歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行正反雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的BRCA1標(biāo)準(zhǔn)序列（NM＿007300.3）進(jìn)行比對(duì)，判斷有無(wú)基因突變，再將突變的位點(diǎn)在乳腺癌信息中心網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)（breast cancer information core，BIC）上作對(duì)照，判定是致病性突變位點(diǎn)、核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)還是新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。根據(jù)HUGO推薦的規(guī)則對(duì)堿基插入和丟失進(jìn)行命名。

表1 部分PCR引物序列和退火溫度

1.4 雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（p rogesterone recep tor）、人表皮生長(zhǎng)因子受體（hum an epiderm al grow th factor-2，HER-2）檢測(cè)方法及結(jié)果判定使用PV9000法對(duì)患者進(jìn)行ER、PR和HER-2表達(dá)的檢測(cè)。ER、PR以細(xì)胞核內(nèi)有棕色顆粒者視為陽(yáng)性細(xì)胞，著色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＞10%視為陽(yáng)性；Her-2以＞10%細(xì)胞膜出現(xiàn)連續(xù)性的棕黃色表達(dá)視為陽(yáng)性，10%～30%為（＋），31%～50%為（＋＋），＞50%為（＋＋＋）。對(duì)于HER-2（＋＋）者再行熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）法檢測(cè)確定HER-2基因擴(kuò)增情況。ER、PR、HER-2均為陰性則定義為T(mén)NBC，其中任何一項(xiàng)陽(yáng)性則定義為非TNBC［4］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，計(jì)數(shù)資料以n或%表示，組間率的比較采用χ2檢驗(yàn)，危險(xiǎn)因素采用二項(xiàng)Logistic回歸分析，對(duì)各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行賦值。

2 結(jié)果

2.1 BRCA1基因突變檢測(cè)對(duì)本組50例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變進(jìn)行檢測(cè)，共發(fā)現(xiàn)13例BRCA1突變的12個(gè)位點(diǎn)，突變率26%（13／50），包括5例致病性突變（FS、NS）和9例意義不明突變（MS、SP）；其中2個(gè)BRCA1基因突變“熱點(diǎn)”：5號(hào)外顯子第212＋1基因拼接點(diǎn)區(qū)G＞T和10號(hào)外顯子2077G＞A；突變位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)在BIC中未有報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)。見(jiàn)表2。非家族性青年TNBC患者BRCA1突變率漢族高于少數(shù)民族（27.6%vs23.8%），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.599）。

2.2 BRCA1基因突變臨床病理特征本組50例新疆非家族性青年TNBC中，BRCA1基因突變組腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于BRCA1基因未突變組（69.2%vs 35.1%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.539，P＜0.05）。BRCA1基因突變組較BRCA1基因未突變組在TNMⅢ、Ⅳ期比例高（77%vs 37.8%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝8.596，P＜0.05）。BRCA1基因突變組與BRCA1基因未突變組在民族、病理類型、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤大小以及Ki-67之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

2.3 BRCA1基因突變組免疫組化及臨床病理分期的Logistic回歸分析新疆地區(qū)50例非家族性青年TNBC患者中13例BRCA1突變組乳腺癌的Logistic分析結(jié)果顯示：Ki-67＞14%、組織學(xué)分化較差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、TNM分期較晚（Ⅲ、Ⅳ期）的患者發(fā)生BRCA1突變的概率分別是Ki-67≤14%、組織學(xué)分化較好、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移、非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌、TNM分期較早（Ⅰ、Ⅱ期）患者的2.800、2.183、4.154、0.521、5.476倍。見(jiàn)表4、5。

表2 50例非家族性青年TNBC患者BRCA1突變檢測(cè)結(jié)果

表3 臨床病理特征比較［n（%）］

3 討論

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，在部分大城市已成為女性惡性腫瘤之首位，發(fā)病年齡也逐漸年輕化［5］。據(jù)國(guó)外文獻(xiàn)［6］報(bào)道，青年乳腺癌占全部乳腺癌的15%～25%。BRCA1基因是與乳腺癌發(fā)病高度相關(guān)的腫瘤抑癌基因，在高危人群（家族性乳腺癌、TNBC、早發(fā)性乳腺癌、雙側(cè)乳腺癌等）中BRCA1突變率較高，國(guó)內(nèi)外關(guān)于家族性乳腺癌與BRCA1的報(bào)道已很多。

表4 觀察參數(shù)統(tǒng)計(jì)賦值表

表5 13例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變免疫組化及臨床病理分期的Logistic回歸分析

本研究以50例非家族性青年TNBC患者為研究對(duì)象，其BRCA1的突變率為26%（13／50）。國(guó)外文獻(xiàn)［7］報(bào)道，不同的研究人群TNBC中BRCA1突變率約11%～38%。而丁曉曼等［8］檢測(cè)北京地區(qū)10例早發(fā)性乳腺癌BRCA1突變率為10%。本研究與國(guó)外同類報(bào)道［7］基本一致，高于國(guó)內(nèi)同類報(bào)道［8］，提示本研究BRCA1基因突變可能與新疆地區(qū)非家族性青年TNBC患者密切相關(guān)。其中漢族患者BRCA1基因突變率高于少數(shù)民族，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中5例BRCA1致病性突變：3例移碼突變3294delT、2952delT、2073delA和1例無(wú)義突變2394C＞T均位于Exon10，1例移碼突變5533＿5540del位于Exon 24。此外發(fā)現(xiàn)的9例意義不明突變中5例位于Exon10，2例位于Introns16，2例位于Exon5；其中13號(hào)標(biāo)本Exon10上發(fā)現(xiàn)了3個(gè)突變位點(diǎn)。本研究顯示BRCA1突變大多位于Exon10，這相關(guān)文獻(xiàn)［9－10］報(bào)道基本一致。同時(shí)發(fā)現(xiàn)2個(gè)BRCA1基因突變“熱點(diǎn)”：212＋1G＞T位于Exon5，2077G＞A位于Exon10，可能為新疆地區(qū)遺傳易感位點(diǎn)，尚需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。突變位點(diǎn)中有4個(gè)位點(diǎn)（3294delT、2941C＞G、2939T＞A、2073delA均位于Exon10）在BIC中未有報(bào)道，為新發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)，豐富了中國(guó)BRCA1突變攜帶譜。這些突變可能與新疆地區(qū)非家族性青年TNBC患者的地域或種族不同有關(guān)系。

本研究中的13例非家族性青年TNBC患者BRCA1基因突變組病理類型多為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，僅3例髓樣癌，與BRCA1基因未突變組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且組織學(xué)分級(jí)兩組相比差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但BRCA1基因突變組青年TNBC患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，TNM分期晚。這與Levanat et al［11］報(bào)道的BRCA1基因突變相關(guān)性乳腺癌具有髓樣癌及Luminal A亞型比例高、腫瘤細(xì)胞分級(jí)高等特點(diǎn)不同。而與劉秀蘭等［12］報(bào)道的結(jié)果相一致。BRCA1基因突變者與BRCA1基因未突變者相比，存在臨床病理組織差異，應(yīng)考慮個(gè)體化治療。

本研究通過(guò)非條件Logistic回歸發(fā)現(xiàn)乳腺癌病理和免疫組化特點(diǎn)對(duì)BRCA1的突變有影響：Ki-67＞14%、組織學(xué)分化較差、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期較晚（Ⅲ、Ⅳ期）是BRCA1突變的危險(xiǎn)因素。本研究表明，可以通過(guò)病理檢測(cè)腫瘤分化程度和病理免疫組化法來(lái)預(yù)測(cè)BRCA1突變的概率。BRCA1的研究對(duì)乳腺癌的病因、預(yù)防、診斷和治療提供有力的支持，但本次研究樣本量較少，尚需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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The relationship between non-fam ilial young trip le negative breast cancer and BRCA1 mutations

Liu Xiaodan，Xu Wenting，Yang Liang，et al
（Dept of Surgery of Breast，The Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830011）

Objective To explore the relationship between non-familial young triple negative breast cancer（TNBC）and BRCA1 gene mutation and discuss the difference of clinical and pathological features between patients with BRCA 1 genemutation and without it.MethodsBRCA 1 genemutationsof5 0 casesnon-familialyoung TNBCpatients were detected by PCR-DNA sequencing in Xinjiang region.Clinical and pathological features were compared and analyzed between patients with BRCA1 gene mutation and without it.Results①The prevalence of BRCA1 mutations in 50 non-familial young TNBC caseswas26%（13／50），which Han is higher than ethnicminorities（27.6%vs23.8%），but the difference was not statistically significant（χ2＝1.599）.②13 cases of BRCA1 mutationswith 12 loci in 50 cases of non-familial young TNBC patients were found，4 of which were new loci；2 BRCA1 genemutation“hot spots”were found.③Compared with no BRCA1 mutation patients，BRCA1 mutation patients in 50 cases of non-familial young TNBC had higher rate of axillary lymph node metastasis（69.2%vs 35.1%），and later rate of TNM stage（77%vs37.8%），the differences were statistically significant（P＜0.05）. Conclusion The prevalence of BRCA1 mutations in patientswith non-familial young TNBC is higher inmulti-ethnic region of Xinjiang.212＋1G＞T and 2077G＞A may be genetic susceptible spot in non-familial young TNBC in Xinjiang region，and requiremore samples to confirm the results.Differences exist in clinical and pathological features between patients with BRCA1 genemutation and without of it.

BRCA1 genes；mutation；non-familial；young women；TNBC；clinical pathological features

R 737.9

A

1000－1492（2015）08－1168－05

2015－03－24接收

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號(hào)：2012211A031）

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，烏魯木齊 830011

劉曉丹，女，碩士研究生；

朱麗萍，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：zlp＿1005＠sina.com