羧基化聚乙烯基萘納米微球的制備和應用

張俊峰，靳 穎，徐 亮，程 帥，王冬梅，王彥春，魏殿軍

羧基化聚乙烯基萘納米微球的制備和應用

張俊峰1，靳 穎2，徐 亮3，程 帥3，王冬梅3，王彥春1，魏殿軍1

以乙烯基萘（VN）為聚合單體，采用乳液聚合法制備聚乙烯基萘（PVN）納米微球。通過對其羧基化與β2微球蛋白（β2-M）抗體偶聯，制成免疫檢測試劑。分別用聚苯乙烯（PS）和PVN檢測試劑測定β2-M含量，數據經統計學處理和分析，對自制的PVN納米微球膠乳增強免疫比濁（LETIA）檢測試劑的性能進行評價。自制的羧基化PVN納米微球免疫試劑成功對標準樣本進行了檢測并在一定范圍內有較好的線性，比PS檢測試劑更加靈敏。利用該研究采用的方法和條件可以成功制備粒徑大小可控、單分散的羧基化PVN納米微球，是比PS更優的LETIA新載體，具有很好的臨床應用前景。

乙烯基萘；膠乳增強免疫比濁法；β2微球蛋白；納米微球

乳液聚合是微球制備最常用的方法，主要以水為分散介質［1］，需要氮氣的保護；乳液聚合無污染或低污染，在工業、農業和生物醫藥等方面得到了廣泛應用［2－4］，是最常使用的免疫分析方法之一。迄今，膠乳增強免疫比濁（latex enhanced turbidimetric immunoassay，LETIA）在臨床中已經應用于C反應蛋白［4］、胱抑素C［5］、前列腺特異性抗原［6］等涉及炎癥、肝腎功能、腫瘤等多個領域項目的檢測。目前LETIA檢測試劑多以聚苯乙烯（polystyrene，PS）納米微球為載體，該基質小粒徑PS微球偶聯抗體量大，可以保證較大線性范圍，然而透光率低，靈敏度較差；大粒徑PS微球可以提升靈敏度，但偶聯抗體量減小，線性范圍相對變窄［7］。該研究采用乳液聚合法首次成功制備了羧基化聚乙烯基萘（polyvinyl naphthalene，PVN）納米微球，可利用較小粒徑微球偶聯較大量抗體，在提供較好靈敏度的同時又保證有較大的線性范圍，將其用作LETIA檢測試劑的載體，有很好的臨床應用前景。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器乙烯基萘（vinyl naphthalene，VN），分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），電泳級，購自天津聯星生物公司；過硫酸鉀（potassium persulfate，KPS），分析純，購自天津市化學試劑批發公司；丙烯酸鈉（95%）購自天津市光復精細化工研究所；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽［1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC 99%］、BSA 99%購自美國Sigma-Aldrich試劑公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS 99%）購自美國Pierce試劑公司；β2微球蛋白（β2-M）及其抗體（IgG 99%）購自深圳菲鵬生物科技有限公司；羧基化PS納米微球購自伊普西隆（浙江瑞安）生物科技有限公司；DelsaTMNano C納米粒度及zeta電勢分析儀購自美國Beckman Coulter公司；380型傅里葉變換紅外光譜儀購自美國Nicolet公司；XL30環境掃描電子顯微鏡購自荷蘭Philips公司；H7180大型生化分析儀和U-3310分光光度計購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 羧基化PVN納米微球的制備 利用乳液聚合法制備羧基化PVN納米微球。稱量0.04～0.15 g乳化劑SDS加入50 ml錐形瓶中，加入碳酸鹽緩沖溶液和引發劑KPS溶液，然后加入VN單體；采用化學鍵合的方法，加入丙烯酸鈉；在微球表面引入羧基，進行功能基化改性，以利于該微球的后續應用。通氮氣10～15 min，密封，振搖乳化10～15 min。最后放入80℃水浴搖床中120 r／min振搖10 h。使用經過處理的透析袋以蒸餾水為透析液透析制備所得的已知粒徑的微球3 d，除去微球中反應后剩余的單體及其他副反應物，將此微球保存于4℃冰箱中，待用。

1.2.2 羧基化PVN納米微球的表征方法 用DelsaTMNano C納米粒度及zeta電勢分析儀測量羧基化PVN納米微球的粒徑以及單分散系數（particle dispersion index，PDI）；采用溴化鉀（KBr）壓片的方法在380型傅里葉變換紅外光譜儀上檢測羧基化PVN微球是否連上羧基；用XL30環境掃描電子顯微鏡觀察納米微球的表面形貌；用U-3310分光光度計在600 nm波長下測量羧基化PVN納米微球的吸光度（absorbance，A），并與同等粒徑的羧基化PS對比。

1.2.3 β2-M-LETIA檢測試劑的制備 取羧基化PS納米微球和羧基化PVN納米微球各適量，分別依次向其中加入等量EDC和NHS對表面進行活化，室溫放置15 min。然后迅速加入等量的β2-M抗體，在37℃恒溫水浴鍋中反應3 h。取出反應物后采用切向流過濾除去游離的β2-M抗體，收集上清液，用于定量鍵合抗體量。下層物質加BSA封閉12 h，即可得到反應溶液R2。配制一定離子強度的反應溶液R1（50mmol／L Tris-HCl緩沖液，pH 7.4），此兩種反應溶液共同組成β2-M-LETIA檢測試劑。

2 結果

2.1 羧基化PVN納米微球制備條件的考察

2.1.1 緩沖液的影響 總體積為10 m l，NaHCO3和Na2CO3濃度分別為20 mmol／L，通過取不同體積的溶液配比調節緩沖液pH值，制備羧基化PVN納米微球，并測量反應后納米微球的粒徑及粒徑分布。實驗結果顯示，NaHCO3和Na2CO3各5 ml時，制備出的羧基化PVN納米微球的PDI為0.033，較低；其他配比條件制備出的微球PDI均大于0.1，單分散性較差。

2.1.2 引發劑濃度的影響 在羧基化PVN納米微球制備過程中，KPS不僅影響反應速度，而且影響納米微球粒徑分布。實驗表明，0.1%的KPS粒徑分布最小為0.038，而KPS濃度為0.3%和0.4%，制備出的羧基化PVN納米微球粒徑和PDI均較大。

2.1.3 VN單體質量的影響 在一定范圍內，羧基化PVN納米微球的粒徑會隨著VN單體量的增加而增加，實驗結果顯示當VN單體含量為1 g時最為合適，單分散性較好。

2.1.4 加入丙烯酸鈉對粒徑的影響 加入不同質量丙烯酸鈉會對納米微球的粒徑產生不同的影響，羧基化PVN納米微球的粒徑會隨丙烯酸鈉量的增加先減小后增大（表1）。

2.1.5 乳化劑濃度的影響 乳化劑SDS對羧基化PVN納米微球的粒徑有顯著性影響，羧基化PVN納米微球的粒徑隨SDS濃度增加而減小（表2）。通過掃描電鏡觀察所得羧基化PVN納米微球為粒徑均勻的球形結構、表面光潔，呈單分散存在（圖1）。

表1 在SDS濃度為0.05%下加入不同質量丙烯酸鈉對納米微球粒徑的影響

表2 乳化劑SDS濃度與羧基化PVN納米微球粒徑關系

2.2 羧基化PVN納米微球的表征

2.2.1 納米微球的紅外光譜圖 PVN、羧基化PVN、羧基化PVN－IgG的紅外光譜如圖2所示。通過（圖2A）、（圖2B）比較VN單體、PVN和羧基化PVN微球的紅外吸收峰位發現，圖2A中1 800 cm－1為烯烴末端－C＝C－H的振動譜帶，1 700～2 000cm－1為萘環及烯烴C＝C的累計雙鍵振動譜帶，1 606 cm－1和1 599cm－1為苯環骨架振動譜帶，指紋區的771 cm－1和696 cm－1為單取代振動譜帶。圖2B在2 920 cm－1和2 848 cm－1為飽和－CH2振動譜帶，1 597 cm－1和1 504cm－1為苯環骨架振動譜帶，1 347 cm－1裂為一強一弱兩個峰，為偕三甲基中碳振動譜帶，證明有飽和碳原子，990 cm－1吸收峰消失，證明末端烯烴消失，771 cm－1和696 cm－1指紋區單取代振動譜帶消失，說明單體VN合成了聚合物微球。比較圖2B中PVN微球和羧基化PVN微球紅外譜圖可以看出，羧基化PVN微球紅外譜圖在1 573 cm－1處出現－C＝O振動譜帶。證明在PVN微球上鍵合了－COOH。圖2C中2 500～3 200 cm－1的寬強峰為－COOH中的締合－OH振動譜帶，1 631 cm－1為－C＝O的吸收峰，1 553 cm－1為－N－H的吸收峰，1 037 cm－1為－COOH中的－C－O吸收峰，說明IgG成功鍵合在微球表面。

2.2.2 羧基化PVN納米微球以及與羧基化PS納米微球的A對比 在特定波長下，同等粒徑的羧基化PVN納米微球比羧基化PS納米微球的A值大，粒徑越大A值相差也越大（表3），說明羧基化PVN納米微球的靈敏度更好。

表3 波長600 nm處羧基化PS與羧基化PVN微球的A值

2.3 β2-M-LETIA試劑的研制及應用

2.3.1 制作檢測試劑因素的考察 經過大量實驗顯示，當每毫升納米微球加入EDC和NHS各0.1 mg和β2-M抗體3 mg時才能制成β2-M-LETIA試劑。

2.3.2 檢測接入β2-M抗體數量 羧基化PS和羧基化PVN微球在接入β2-M抗體后，微球的粒徑和PDI均有所增加。由表2～5可以看出PS微球粒徑120 nm時接入抗體量較大，120 nm的PVN微球接入量較同粒徑的PS微球大（表4）。

表4 羧基化PS和羧基化PVN接入抗體數量

2.3.3 標準曲線 以理論濃度（0、2.5、5.0、10.0、17.5、25.0 mg／L）為橫坐標、試劑測量數據A值為縱坐標，在0～25 mg／L的濃度范圍內，考察以PVN和PS納米微球為載體的β2-M-LETIA試劑的線性范圍并繪制標準曲線（圖3）。如圖所示，自制的羧基化PVN納米微球檢測試劑的線性范圍較羧基化PS納米微球的線性范圍要好。120 nm羧基化PS納米微球在理論濃度為0～10 mg／L內呈線性，在0～5 mg／L范圍內其相關系數可以達到0.981 5。150 nm羧基化PS納米微球在理論濃度為0～5 mg／L內呈線性，其相關系數可以達到0.998 8。而120 nm羧基化PVN納米微球在理論濃度為0～17.5 mg／L內呈線性，在0～10 mg／L內其相關系數可以達到0.902 3。因此，PVN納米微球作為LETIA試劑的載體材料與PS相比有更高的靈敏度并且可以提供較大的線性范圍。

2.3.4 臨床樣本的方法建立檢測 用正常人血清和50 mg／L的標準品配制3個樣品即S0：正常人血清500μl；S1：正常人血清450μl＋標準品50μl；S2：正常人血清350μl＋標準品150μl。分別將PS納米微球和PVN納米微球檢測試劑在同一大型生化分析儀上在600 nm處對臨床樣本中的β2-M進行檢測，并將測試結果進行比對，結果見表5。在測量低值實際樣品時，120 nm的PVN納米微球試劑和120、150 nm PS納米微球試劑的回收率處于95%～105%，說明測量準確；測量高值實際樣品時，由于120 nm PVN納米微球試劑標準曲線線性范圍較大，可以得到較高回收率，即測量結果較準確。通過實際樣品測量比較，可知自制以羧基化PVN納米微球為載體的β2-M－LETIA檢測試劑有明顯優勢。

表5 PVN和PS試劑臨床樣本的檢測結果

3 討論

本文研究了pH值、引發劑和VN單體濃度、乳化劑添加量等各因素在羧基化PVN納米微球的制備過程中對其粒徑及粒徑分布的影響：①pH緩沖劑：離子型乳化劑只有在一定的pH值范圍內才能起到有效的乳化作用。SDS為陰離子型乳化劑，需要在堿性介質中使用，在使用PBS緩沖體系時微球制備均聚集，后采用NaHCO3-Na2CO3作為緩沖液；②單體：在一定范圍內，羧基化PVN納米微球的粒徑會隨著VN單體量的增加而增加；③乳化劑：乳化劑對羧基化PVN納米微球的粒徑有顯著的影響，微球粒徑隨乳化劑濃度的增大而減小；④丙烯酸鈉：羧基化PVN納米微球的粒徑會隨丙烯酸鈉量的增加先減小后增大。由于丙烯酸鈉本身有兩親性，加入量較小時起乳化劑作用；隨丙烯酸鈉加入量增加，微球粒徑逐漸減小，超過臨界值，起鹽溶液作用，粒徑隨加入量的增加而增大。通過對這些影響因素詳細地考察，達到對羧基化PVN納米微球的粒徑大小和分布進行調控。通過一系列的考察可以得知，以1 g VN為單體，SDS為乳化劑，各5m l的20mmol／L的NaHCO3和Na2CO3為緩沖溶液，0.1%KPS為引發劑，對得到的羧基化PVN用掃描電鏡、激光粒度儀、傅里葉紅外光譜儀進行表征，表明合成的羧基化PVN微球表面光滑，單分散性好，球形度好，證實可制備出優良的羧基化PVN納米微球。目前，課題組已經能夠成功地制備粒徑范圍在60～200 nm的羧基化PVN納米微球。

通過A值的比較，證明自制的羧基化PVN納米微球的靈敏度要比羧基化PS納米微球高，并通過與抗體偶聯制備成β2-M-LETIA試劑應用于臨床樣品檢測進行驗證。經實驗證明PVN納米微球檢測試劑更靈敏，有更好的線性范圍，在測量小于17.5 mg／L濃度范圍的樣品時準確度更高。PVN納米微球與同粒徑的PS納米微球相比有更高的靈敏度，與大粒徑的PS納米微球相比有較寬的線性范圍。通過實際樣品測量比較可知自制以羧基化PVN納米微球為載體的β2-M-LETIA檢測試劑具有明顯優勢，PVN納米微球作為LETIA試劑的載體材料有很大的臨床應用潛力。

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Preparation and app lication of carboxylic polyvinyl naphthalene nanospheres

Zhang Junfeng1，Jin Ying2，Xu Liang3，et al
（1The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300211；2The Affiliated Hospital of Armed Police Force Logistics Institute，Tianjin 300163；3Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Developmentof Clinical Therapeutics and Diagnostics，School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

Using vinyl naphthalene（VN）as the monomer，polyvinyl naphthalene（PVN）nanometermicrospheres were synthesized by emulsion polymerization，which were made for immunodetection reagents by carboxylating and coating withβ2-microglobulin（β2-M）antibody.β2-M was determined respectively using polystyrene（PS）and PVN immunodetection reagents and the results were statistically processed and analyzed，the purpose of which was that the performance of PVN-homemade nanoparticles carrier for latex enhanced turbidimetric immunoassay（LETIA）was evaluated.Immunological reagents of carboxylated PVN nanospheres had been successfully used for testing standard samples and having good linearity，therefore they weremore sensitive than that of PS nanospheres.Controllable particle size，monodisperse carboxylated PVN nanoparticles can be successfully synthesized by using method and conditions of this paper and have good prospects for clinical application，which are better than thatof PSnanospheres carrier for LETIA.

vinyl naphthalene；latex enhanced turbidimetric immunoassay；β2-microglobulin；nanospheres

R 318.08；R 313；R 446.11＋2

A

1000－1492（2015）08－1184－05

2015－04－08接收

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（編號：14JCYBJC24300）

1天津醫科大學第二醫院檢驗科，天津 300211

2武警后勤學院附屬醫院，天津 300163

3天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津醫科大學藥學院，天津 300070

張俊峰，男，碩士，技師；

徐 亮，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：xuliang＠tmu.edu.cn；

靳 穎，女，副主任技師，責任作者，E-mail：jinying9032＠hotmail.com