PGE2對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠骨髓源性樹突細(xì)胞成熟及EP4受體表達(dá)影響

盛康亮，李 影，付靜靜，陳鏡宇，張玲玲，魏偉

◇基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究◇

PGE2對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠骨髓源性樹突細(xì)胞成熟及EP4受體表達(dá)影響

盛康亮*，李 影*，付靜靜，陳鏡宇，張玲玲，魏偉

目的觀察不同濃度前列腺素E2（PGE2）刺激對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠骨髓源性樹突細(xì)胞（DCs）成熟及EP4受體表達(dá)的影響。方法采用重組小鼠粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組小鼠白細(xì)胞介素4（rmIL-4）刺激小鼠骨髓源細(xì)胞，誘導(dǎo)生成DCs；經(jīng)LPS（100 ng／ml）誘導(dǎo)成熟后，用不同濃度PGE2（0.625、1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）刺激DCs 24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DCs表型CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表達(dá)和抗原攝取功能，熒光間標(biāo)法檢測(cè)小鼠骨髓源DCs細(xì)胞膜上EP4的表達(dá)，以平均熒光強(qiáng)度表示表達(dá)的高低；MTT法檢測(cè)經(jīng)PGE2及LPS誘導(dǎo)成熟的DCs對(duì)T細(xì)胞增殖的作用。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）能明顯上調(diào)CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表達(dá)；PGE2（1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）能明顯抑制DCs的抗原攝取功能；MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示PGE2（2.5、5、10 nmol／L）刺激DCs能促進(jìn)T細(xì)胞增殖的作用；熒光間標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示PGE2（2.5、5、10 nmol／L）明顯升高DCs細(xì)胞膜上EP4表達(dá)。結(jié)論P(yáng)GE2可以調(diào)節(jié)DCs功能，該作用可能與其調(diào)節(jié)EP4受體表達(dá)相關(guān)。

EP4受體；樹突細(xì)胞；PGE2

前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）是花生四烯酸類物質(zhì)的重要代謝產(chǎn)物，具有較強(qiáng)的免疫活性，可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的發(fā)育、功能以及存活［1］。前列腺素E2受體（E-prostanoid receptors，EPs）分為4個(gè)亞型，即EP1、EP2、EP3和EP4。EP2和EP4受體通過(guò)偶聯(lián)Gs蛋白，激活腺苷酸環(huán)化酶，從而增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的水平［2］。PGE2與其不同EP受體結(jié)合，促進(jìn)了白細(xì)胞介素（interleukin）6和組胺的釋放，影響血管的通透性，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生［3］。研究［4］顯示多數(shù)免疫細(xì)胞均表達(dá)EP受體。但研究［5］多集中在巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞。樹突細(xì)胞（dendritic cells，DCs）作為目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)大的專職抗原遞呈細(xì)胞，在參與免疫反應(yīng)中起重要作用［6］。研究［7］報(bào)道，體外培養(yǎng)DCs能產(chǎn)生花生四烯酸產(chǎn)物，特別是PGE2。另有報(bào)道［8］PGE2主要通過(guò)EP4調(diào)節(jié)DCs的功能。但不同濃度PGE2對(duì)DCs成熟有怎樣的調(diào)節(jié)作用，其對(duì)DCs成熟的調(diào)節(jié)是否通過(guò)影響EP4受體的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，目前未見相關(guān)研究。該研究觀察不同濃度PGE2對(duì)DCs功能的影響以及與EP4表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)健康C57BL／6小鼠，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，7～8周齡，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)化清潔環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑重組小鼠白細(xì)胞介素4（recombinant IL-4，rmIL-4）、重組小鼠粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rm granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rmGM-CSF）、FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Pepretech公司；RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；PE標(biāo)記的CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ及同型對(duì)照IgG購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；EP4受體一抗購(gòu)自美國(guó)Santa公司；；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、FITC-Dextran（40 ku）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 DCs的分離與培養(yǎng)小鼠脫臼處死后，在超凈臺(tái)無(wú)菌條件下分離小鼠后肢股骨和脛骨，75%酒精浸泡3 min，用5 ml注射器用PBS反復(fù)洗2次；去除骨兩端，用5 ml注射器抽取滅菌后的PBS液反復(fù)沖洗出骨髓直至骨髓腔變白；用200目紗網(wǎng)過(guò)濾沖洗出的骨髓懸液，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，根據(jù)骨髓細(xì)胞數(shù)量，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640，細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到5×109／L；鋪在6孔培養(yǎng)板中，每孔2 ml，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，使得細(xì)胞貼壁，3 h更換新鮮培養(yǎng)基，并加入rmGMCSF（終濃度20 μg／L）和rmIL-4（終濃度20 μg／L）；于第3、5天，隔日半量換液，棄去半量上清液，重新加入含10%胎牛血清和rmGM-CSF（20 μg／L）、rmIL-4（20 μg／L）的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)至第6天，吹打、收集粘附的細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)［4］。

1.4 DCs的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)及DCs細(xì)胞表型的鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)至第3、5、7天，分別鏡下觀察細(xì)胞是否具有成簇生長(zhǎng)、突起、毛刺等樹突細(xì)胞特征。收集培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞，輕輕吹打，收集粘附的細(xì)胞，2 000 r／min離心10 min，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量5×106／ml，加入流式管中，每管100 μl。分別加入FITC標(biāo)記的CD11c（小鼠DCs特異性表面標(biāo)記物）抗體及同型對(duì)照抗體，4℃孵育30 min后，再加入300 μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)CD11c細(xì)胞比例，鑒定DCs并確定相關(guān)培養(yǎng)條件。

1.4.2 對(duì)DCs的干預(yù) 培養(yǎng)至第6天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，設(shè)空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組LPS（100 ng／ml）、處理組PGE2（0.625、1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）＋LPS（100 ng／ml），24 h后收集DCs檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.5 DCs的表型及功能檢測(cè)

1.5.1 骨髓源DCs表型和EP4表達(dá)的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，輕輕吹打、收集粘附的細(xì)胞，2 000 r／min離心10 min，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量5×106／ml，每管100 μl。DCs表型檢測(cè)每管細(xì)胞分別加入PE標(biāo)記的CD40、CD80、CD83、MHC-Ⅱ及同型對(duì)照IgG，EP4表達(dá)的檢測(cè)每管細(xì)胞加入兔源性抗EP4受體一抗（1∶100），孵育，PBS洗滌，加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶250）避光孵育，用僅加入FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育的DCs作為同型對(duì)照。4℃避光孵育30 min后，加入300 μl PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。去除非特異性染色后，比較平均熒光強(qiáng)度的變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以X軸平均熒光強(qiáng)度的變化表示DCs表型的表達(dá)。

1.5.2 DCs攝取功能的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，輕輕吹打、收集粘附的細(xì)胞，2 000 r／min，離心10 min，PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量5×106／ml，培養(yǎng)于1.5 ml EP管中，每管100 μl，加入PBS稀釋的FITC-Dextran（終濃度為1 mg／ml），置于37℃溫育2 h后取出，PBS洗滌重懸于400 μl PBS中，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。其他條件相同4℃孵育作為對(duì)照。以X軸平均熒光強(qiáng)度的變化表示DCs的吞噬能力。

1.5.3 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng) 超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌條件下取小鼠脾臟，制成單細(xì)胞懸液，用紅細(xì)胞裂解液處理，除去紅細(xì)胞，2 000 r／min離心10 min，棄上清液，采用尼龍毛柱法，去除細(xì)胞懸液中的B淋巴細(xì)胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106／ml，作為反應(yīng)細(xì)胞。分別以培養(yǎng)至第7天的各處理組DCs為刺激細(xì)胞，以25 μg／ml的絲裂霉素C加入刺激細(xì)胞中，將其置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，滅活。將刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞按不同比例混合，加入96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。MTT法分析DCs對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖能力的影響。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺激細(xì)胞和反應(yīng)細(xì)胞（1∶10）比例混合具有刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 DCs的培養(yǎng)與鑒定小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)rmGMCSF和rmIL-4刺激，培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞成簇生長(zhǎng)。第5天，多數(shù)細(xì)胞呈懸浮狀，可見突起，呈毛刺狀。收集培養(yǎng)至第7天的細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 PGE2對(duì)DCs表型及功能的影響

2.2.1 PGE2對(duì)DCs表面分子CD40、CD83、MHC-Ⅱ表達(dá)的影響 與LPS（100 ng／ml）組比較，PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）組能明顯上調(diào)CD40、MHC-Ⅱ的表達(dá)（P＜0.01）；PGE2（2.5、5 nmol／L）組能明顯上調(diào)CD83的表達(dá)（P＜0.01）；PGE2（0.625、20 nmol／L）對(duì)CD40、CD83、MHC-Ⅱ的表達(dá)均無(wú)明顯影響，所有劑量組對(duì)CD80均無(wú)明顯影響，見圖1。

2.2.2 PGE2對(duì)DCs抗原攝取能力的影響 與LPS （100 ng／ml）組比較，PGE2（1.25、2.5、5、10、20 nmol／L）刺激組DCs的抗原攝取能力明顯降低（P ＜0.01），PGE2（0.625 nmol／L）刺激組DCs的抗原攝取能力無(wú)變化，見圖2。

2.2.3 PGE2處理的DCs對(duì)T細(xì)胞增殖的影響與LPS（100 ng／ml）組比較，PGE2（2.5、5、10 nmol／L）處理的DCs能明顯增強(qiáng)T細(xì)胞增殖（P＜0.01），PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）處理的DCs對(duì)T細(xì)胞增殖無(wú)增強(qiáng)作用，見圖3。

2.2.4 PGE2對(duì)小鼠DCs表面EP4表達(dá)的影響與LPS（100 ng／ml）組比較，刺激組DCs經(jīng)較高濃度PGE2（2.5、5、10 nmol／L）刺激后FITC平均熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)（P＜0.01），提示PGE2刺激后EP4胞膜表達(dá)明顯上升。但PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）刺激后，F(xiàn)ITC平均熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，EP4胞膜表達(dá)無(wú)明顯變化，見圖4。

3 討論

PGE2調(diào)節(jié)多種免疫和炎癥性過(guò)程，如細(xì)胞因子的產(chǎn)生，抗體的形成，吞噬和細(xì)胞增殖。PGE2有促炎和抗炎雙重作用。有報(bào)道［9］PGE2通過(guò)抑制T細(xì)胞增殖和IL-2受體的表達(dá)，降低IL-2的釋放，發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，進(jìn)而抑制了干擾素-γ的分泌，因此PGE2抑制輔助性T細(xì)胞1功能；但Yao et al［10］報(bào)道PGE2通過(guò)EP4受體作用于T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)輔助性T細(xì)胞1的分化和輔助性T細(xì)胞17的擴(kuò)增。PGE2在不同的微環(huán)境下表現(xiàn)出對(duì)DCs功能截然不同的作用。在外周組織中PGE2對(duì)DCs有促進(jìn)作用，誘導(dǎo)其成熟和轉(zhuǎn)移。一旦DCs轉(zhuǎn)移到淋巴器官，PGE2呈現(xiàn)抑制DCs功能，抑制其成熟及抗原的呈遞功能。此外，PGE2在不同的促炎因子及免疫細(xì)胞作用下也表現(xiàn)出對(duì)DCs功能截然不同的作用。PGE2降低IL-12并通過(guò)抑制MHCⅡ分子的表達(dá)調(diào)節(jié)抗原呈遞。PGE2可以加強(qiáng)DCs的分化并影響輔助性T細(xì)胞的能力。PGE2聯(lián)合促炎因子如IL-1，腫瘤壞死因子-α，IL-6等促進(jìn)DCs的成熟［11］。

本研究顯示不同劑量的PGE2對(duì)DCs的功能有不同的作用，PGE2（2.5、5、10 nmol／L）能促進(jìn)DCs的成熟，而PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）對(duì)DCs成熟沒(méi)有明顯作用。這種不同濃度的PGE2對(duì)DCs功能影響的不同，可能由于其通過(guò)不同EP受體誘導(dǎo)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑產(chǎn)生的。實(shí)驗(yàn)顯示，PGE2 （2.5、5、10 nmol／L）刺激后EP4胞膜表達(dá)上升，促進(jìn)DCs成熟，而PGE2（0.625、1.25、20 nmol／L）刺激后，EP4胞膜表達(dá)下降，對(duì)DCs成熟無(wú)作用。研究［10］報(bào)道EP4激動(dòng)劑（ONO-AE1-329）增強(qiáng)DCs表面CD83的表達(dá)，促進(jìn)DCs成熟，而EP1和EP3無(wú)明顯作用。PGE2作用于DCs可以增強(qiáng)其表面分子CD83的表達(dá)，與EP4受體激動(dòng)劑（ONO-AE1-329）呈現(xiàn)相似的表現(xiàn)。PGE2促進(jìn)DCs成熟的作用是通過(guò)EP4受體調(diào)節(jié)這一現(xiàn)象，可以用選擇性EP4受體拮抗劑（ONO-AE3-208）作用于經(jīng)過(guò)PGE2刺激后的DCs證實(shí)。用cAMP類似物模擬PGE2的作用，表明PGE2促進(jìn)DCs成熟的作用是通過(guò)cAMP調(diào)節(jié)的［12］。不僅EP4在DCs的成熟中發(fā)揮作用，還參與了T淋巴細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，T淋巴細(xì)胞在缺乏EP1和EP3的情況下一樣對(duì)PGE2敏感，而在缺乏EP4表達(dá)的情況下抵抗PGE2的作用［13］。PGE2通過(guò)EP4影響下游Gas蛋白的表達(dá)和cAMP水平，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)DCs功能的作用［14］。根據(jù)這些研究推測(cè)，不同濃度PGE2對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠骨髓源性DCs成熟的差異與其調(diào)節(jié)EP4受體的表達(dá)的高低有關(guān)。

［1］ Hayashi A，Hirokawa Y S，Kagaya M，et al.Inflammatory suppressive effect of prostate cancer cells with prolonged exposure to transforming growth factor on macrophage-differentiated cells via downregulation of prostaglandin E2［J］.Oncol Lett，2014，8（4）：1513－8.

［2］ Eskildsen M P，Hansen P B，Stubbe J，et al.Prostaglandin I2 and prostaglandin E2 modulate human intrarenal artery contractility through prostaglandin E2-EP4，prostacyclin-IP，and thromboxane A2-TP receptors［J］.Hypertension，2014，64（3）：551－6.

［3］ Hao S，Hernandez A，Quiroz-Munoz M，et al.PGE（2）EP（3）receptor down-regulates COX-2 expression in the medullary thick ascending limb induced by hypertonic NaCl［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2014，307（6）：736－46.

［4］ Fu J，Liang J，Kang H，et al.The stimulatory effect of different CpG oligonucleotides on the maturation of chicken bone marrowderived dendritic cells［J］.Poult Sci，2014，93（1）：63－9.

［5］ Haque S，Yan X J，Rosen L，et al.Effects of prostaglandin E2 on p53 mRNA transcription and p53 mutagenesis during T-cell-independent human B-cell clonal expansion［J］.FASEB J，2014，28 （2）：627－43.

［6］ Jia X Y，Chang Y，Sun X J，et al.The role of prostaglandin E2 receptor signaling of dendritic cells in rheumatoid arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2014，23（1）：163－9.

［7］ Harizi H，Gualde N.Dendritic cells produce eicosanoids，which modulate generation and functions of antigen-presenting cells［J］. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，2002，66（5－6）：459 －66.

［8］ Poloso N J，Urquhart P，Nicolaou A，et al.PGE2 differentially regulates monocyte-derived dendritic cell cytokine responses depending on receptor usage（EP2／EP4）［J］.Mol Immunol，2013，54（3－4）：284－95.

［9］ Saha A，Biswas A，Srivastav S，et al.Prostaglandin E2 negatively regulates the production of inflammatory cytokines／chemokines and IL-17 in visceral leishmaniasis［J］.J Immunol，2014，193（5）：2330－9.

［10］Yao C，Sakata D，Esaki Y，et al.Prostaglandin E2-EP4 signaling promotes immune inflammation through Thl cell differentiation and Th17 cell expansion［J］.Nat Med，2009，15（6）：633－40.

［11］Comerford I，Harata-Lee Y，Bunting M D，et al.A myriad of functions and complex regulation of the CCR7／CCL19／CCL21 chemokine axis in the adaptive immune system［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（3）：269－83.

［12］Hedi H，Christophe G，Norbert G.Prostaglandin E2 modulates dendritic cell function via EP2 and EP4 receptor subtypes［J］.J Leukoc Biol，2003，73（6）：756－63.

［13］Ma′slanka T，Spodniewska A，Barski D，et al.Prostaglandin E2 down-regulates the expression of CD25 on bovine T cells，and this effect is mediated through the EP4 receptor［J］.Vet Immunol Immunopathol，2014，160（3－4）：192－200.

［14］Xia S，Ma J，Bai X，et al.Prostaglandin E2 promotes the cell growth and invasive ability of hepatocellular carcinoma cells by upregulating c-Myc expression via EP4 receptor and the PKA signaling pathway［J］.Oncol Rep，2014，32（4）：1521－30.

The effect of prostaglandin E2 on maturation and EP4 expression on dendritic cell induced by LPS

Sheng Kangliang，Li Ying，F(xiàn)u Jingjing，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University；Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education；Co-Innovation Center for Anti-inflammatory and Immune Medicine，Hefei 230032）

ObjectiveTo investigate the effects of PGE2 in the different concentrations on the maturation of bone marrow-derived dendritic cells（DCs）of mouse stimulated by LPS and EP4 expression.MethodsThe bone marrow-derived DCs were induced in the presence of recombinant granulocyte macrophage colony stimulating factor （rmGM-CSF）and rmIL-4.Maturated DCs were induced by LPS（100 ng／ml），and then were treated with PGE2 in different concentrations（0.625，1.25，2.5，5，10，20 nmol／L）for 24 h.The ability of antigen uptake and the expressions of CD40，CD83 and MHC-Ⅱon DCs surface were analyzed by flow cytometry；EP4R expression was also measured by flow cytometry.T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction was analyzed by MTT assay.ResultsPGE2（2.5，5，10 nmol／L）significantly enhanced the expression of CD40，CD83，MHC class II molec-ules.However，PGE2 had no effect on CD80 expression in all of concentrations.PGE2（1.25，2.5，5，10，20 nmol／L）significantly inhibited the ability of antigen uptake of DCs.DCs stimulated by PGE2（2.5，5，10 nmol／L）could promote T cell proliferation.PGE2（2.5，5，10 nmol／L）increased EP4 expression on DCs surface.ConclusionPGE2 could regulate DCs function，which might be related to EP4 receptor expression affected by PGE2.

EP4R；dendritic cells；PGE2

R 392.12

A

1000－1492（2015）07－0879－06

2015－03－16接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81330081，31100640，81173075，81473223）；中國(guó)博士后科學(xué)基金第54批面上資助（編號(hào)：2013M540509）

安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥230032

盛康亮，男，碩士研究生；張玲玲，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：llzhang ＠ahmu.edu.cn；魏 偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn

*對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)