C57BL／6小鼠動脈粥樣硬化中CD4＋CD25＋Treg和TGF-β的表達及其意義

陳越峰，陶琳琳，王慶航，朱 潔，周碧蓉

C57BL／6小鼠動脈粥樣硬化中CD4＋CD25＋Treg和TGF-β的表達及其意義

陳越峰，陶琳琳，王慶航，朱 潔，周碧蓉

目的通過建立C57BL／6小鼠動脈粥樣硬化模型探討CD4＋CD25＋調節性T細胞（Treg）在動脈粥樣硬化發病及治療過程中的作用。方法24只雄性C57BL／6小鼠隨機分為3組：正常對照組、動脈粥樣硬化組、阿托伐他汀組。正常對照組給予基礎飼料，其余組給予高脂飼料。高脂飼養4周后，阿托伐他汀組繼續高脂飼養并加用阿托伐他汀干預，3組共觀察16周。蘇木精染色觀察血管病變情況，流式細胞儀檢測外周血CD4＋CD25＋Treg的表達情況，ELISA法檢測外周血TGF-β濃度。結果①動脈粥樣硬化組的動脈血管的內膜顯著增生，CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細胞比例顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。阿托伐他汀組的動脈血管較動脈粥樣硬化組病變明顯減輕。阿托伐他汀組的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細胞比例較動脈粥樣硬化組有顯著提升（P＜0.01），與正常對照組差異無統計學意義。②動脈粥樣硬化組TGF-β濃度較正常對照組明顯降低（P＜0.01）。阿托伐他汀組的TGF-β的濃度顯著高于動脈粥樣硬化組（P＜0.01）；較正常對照組略低，差異無統計學意義。結論CD4＋CD25＋Treg及其分泌的TGF-β具有抑制動脈粥樣硬化發展的作用，有望成為治療動脈粥樣硬化的新靶點。

調節性T細胞；動脈粥樣硬化；流式細胞儀；阿托伐他汀

動脈粥樣硬化是一種血管壁有大量脂質沉積的慢性炎癥疾病，好發于大動脈并伴隨有免疫細胞的浸潤，如巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和T淋巴細胞［1］。研究［2］證明免疫反應在動脈粥樣硬化的發展中起著重要的作用，但是其相關的機制并不明確。CD4＋CD25＋調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）是一種具有抑制功能的T細胞亞群，Treg在紅斑狼瘡、白血病以及動脈粥樣硬化的病理過程中發揮著重要的作用［3］。Treg數量的減少將會破壞機體自身免疫耐受調節［4］。轉化生長因子β（transforming growth factor，TGF-β）是CD4＋CD25＋Treg主要產生的一種細胞因子［5］。Treg在動脈粥樣硬化中的作用已經成為當前研究的熱點。該研究通過建立C57BL／6小鼠模型探討動脈粥樣硬化發病過程中的CD4＋CD25＋Treg及相關因子TGF-β的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型建立24只SPF級雄性C57BL／6小鼠，實驗初始體重為（25±5）g，由安徽醫科大學動物中心提供。適應性飼養1周，隨機分為3組：正常對照組，動脈粥樣硬化組，阿托伐他汀組，每組8只，其中正常對照組給予基礎飼料，動脈粥樣硬化組和阿托伐他汀組給予高脂飼料（含81.85%基礎飼料、0.15%膽固醇、18%豬油）；飼養4周后，阿托伐他汀組繼續用高脂飼料并加用阿托伐他汀干預［阿托伐他汀溶于無菌生理鹽水中，按2.5 mg／（kg·d）灌胃］［6］。各組小鼠均自由飲水。動物模型制備時間為16周。

1.2 主要藥物和試劑阿托伐他汀片購自美國輝瑞公司；小鼠Treg流式試劑盒購自美國eBioscience公司；小鼠TGF-β試劑盒購自美國Becton Dickinson公司；小鼠外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司；蘇木精試劑盒購自北京海德生物公司；豬油為市售使用豬油。

1.3 組織標本留取16周飼養結束后，小鼠禁食12 h后處死，用水合氯醛1 mg／kg腹腔注射麻醉，固定于手術臺上，剖開胸腔、腹腔、心包，先后用0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛從左心室逆行灌注固定主動脈后，自心臟根部至髂主動脈分叉處離斷后取出，10%的中性福爾馬林固定，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，主動脈根部開始，行連續石蠟切片，切片厚度為5 μm，每張切片取2個組織面，每隔10張取1張切片，每只小鼠取4張，行HE染色。

1.4 流式細胞儀檢測小鼠內眥靜脈采血0.3 ml，生理鹽水稀釋至1 ml，取一支15 ml離心管，加入1 ml分離液置于18～22℃條件下。將血液樣本小心加于分離液液面上。18～22℃，1 500 r／min離心20 min。離心后，用吸管小心吸出分離液上層（包含白細胞的細胞層）0.5 cm以上的上清液，棄去。用吸管小心吸取分離液層、白細胞層及紅細胞層置于另一新離心管內。所得離心管中加入10 ml細胞洗滌液混勻。18～22℃，1 200 r／min離心10 min。棄上清液，重復1次，細胞計數。每管加入細胞濃度為1×106／ml的淋巴細胞懸液，1號管加入0.125 μg CD4 FITC及0.06 μg CD25 PE抗體，各管加入相應的同型對照。加入預冷的流式細胞染色緩沖液500 μl洗滌細胞，1 000 r／min離心10min，沉淀細胞，棄上清液。用500 μl的流式細胞儀染色緩沖液重懸細胞，上機檢測。

1.5 外周血TGF-β濃度小鼠內眥靜脈采血0.3 ml，3 000 r／min離心后取得血清，使用ELISA法測定TGF-β細胞因子濃度，按照試劑盒說明書步驟。根據標準品的濃度以及相對應的光密度（optical density，OD）450值分析作出細胞因子的標準曲線圖，根據酶標儀檢測得到標本的吸光值（檢測波長為450 nm），用標準曲線二次方程式計算TGF-β的濃度。

1.6 統計學處理采用SPSS 11.0軟件進行分析，計量資料以±s表示。組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 形態學改變小鼠主動脈根部組織學特征：實驗16周后小鼠主動脈做切片及HE染色，正常對照組動脈血管壁外部和內壁的彈性板完整、清晰、內皮細胞的核心染色排列均勻（圖1A）。其余各組動脈血管壁均有不同程度的變化。其中，動脈粥樣硬化組血管壁不均勻增厚，血管壁有炎癥細胞浸潤，脂質沉積（圖1B）。與動脈粥樣硬化組比較，阿托伐他汀組的血管壁增厚，少量炎癥細胞浸潤，病變明顯減輕（圖1C）。

2.2 流式細胞儀檢測外周血Treg及TGF-β的濃度動脈粥樣硬化組的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細胞的比例顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。阿托伐他汀組的CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細胞的比例較動脈粥樣硬化組有顯著的提升，差異有統計學意義（P＜0.01）；與正常對照組比較差異無統計學意義。動脈粥樣硬化組TGF-β濃度顯著低于正常對照組，阿托伐他汀鈣組的TGF-β的濃度顯著高于動脈粥樣硬化組，差異有統計學意義，見表1、圖2。

表1 各組小鼠外周血CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細胞和TGF-β的濃度（n＝8，±s）

表1 各組小鼠外周血CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T細胞和TGF-β的濃度（n＝8，±s）

與正常對照組比較：**P＜0.01；與動脈粥樣硬化組比較：＃＃P＜0.01

項目正常對照組動脈粥樣硬化組阿托伐他汀組F值CD4＋CD25＋Treg／CD4＋（%）10.25±1.196.45±1.24**9.75±1.17＃＃30.23 TGF-β濃度（ng／ml）18.32±3.838.55±3.26**16.93±3.67＃＃28.30

3 討論

動脈粥樣硬化病變形成過程中免疫反應貫穿始終。失衡的免疫內環境加速動脈粥樣硬化的進展。Treg是一類CD4＋T細胞亞群，是免疫反應系統重要組成部分。Treg維持機體的免疫耐受，調節免疫系統平衡、控制自身免疫性疾病以及動脈粥樣硬化的病理過程［7］。

本研究顯示，C57BL／6小鼠在飼養16周后，動脈粥樣硬化組的小鼠血管病變明顯加重，CD4＋CD25＋Treg數量較正常對照組明顯下降，差異有統計學意義，證明CD4＋CD25＋Treg可以有效抑制小鼠的動脈粥樣硬化的病變。研究［8］證明輸注CD25特異性抗體PC61可以顯著增加斑塊面積及炎癥細胞浸潤，證明CD4＋CD25＋Treg可抑制動脈粥樣硬化的發展，本實驗結果與上述研究一致。阿托伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，對抑制動脈粥樣硬化病變的發展進程和穩定斑塊具有重要的作用，能夠明顯降低心腦血管的發生率和死亡率，在臨床上已經得到驗證［9］。本實驗顯示阿托伐他汀干預后，與動脈粥樣硬化組比較，阿托伐他汀組小鼠的動脈血管病變明顯減輕，CD4＋CD25＋Treg數量明顯上升。研究［10］表明可能是因為阿托伐他汀能抑制樹突狀細胞的成熟，而不成熟的樹突狀細胞能夠誘導Treg的形成，使Treg增多，從而抑制動脈粥樣硬化病變的發展，進一步證明CD4＋CD25＋Treg在動脈粥樣硬化中的作用。研究［11］證明體外實驗中TGF-β可以促進Treg的成熟，協助Treg的存活和功能發揮。阻斷TGF-β信號通路會活化效應T細胞，抑制Treg的成熟，減少Treg數量，大幅降低Treg的免疫抑制的能力［12］。本實驗結果顯示動脈粥樣硬化組的TGF-β濃度較正常對照組顯著降低，而經過阿托伐他汀的治療后，動脈粥樣硬化病變的程度明顯減輕，顯示TGF-β對動脈粥樣發展起到抑制作用。本研究顯示動脈粥樣硬化發展和治療的過程中CD4＋CD25＋Treg比例的變化與TGF-β的濃度變化呈一致性，推測CD4＋CD25＋Treg能夠抑制動脈粥樣硬化發展的作用機制可能是因為分泌TGF-β這樣具有免疫抑制作用的細胞因子，可能TGF-β的水平不足導致誘導分化Treg的能力下降，從而致使Treg的數量減少，Treg數量不足，分泌TGF-β不足，機體對炎癥反應抑制減弱，從而加重病變。經過阿托伐他汀干預后，Treg的數量上升，上調TGF-β濃度，促使動脈粥樣硬化的病變減輕。因此，TGF-β對Treg的數量和功能都具有重要的作用，CD4＋CD25＋Treg及其分泌的TGF-β可以有效抑制動脈粥樣硬化的發展。

綜上所述，Treg參在動脈粥樣硬化的形成和發展中發揮著重要作用。研究結果為應用Treg治療動脈粥樣硬化提供新的方向，有望成為治療動脈粥樣硬化的新靶點。

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Expression and significance of CD4＋CD25＋Treg cells and TGF-β in C57BL／6 mice model of atherosclerosis

Chen Yuefeng，Tao Linlin，Wang Qinghang，et al
（Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate effects and mechanism on CD4＋CD25＋Treg in C57BL／6 mice model of atherosclerosis.MethodsTwenty-four male C57BL／6 mice were assigned to three groups：control group，atherosclerosis group and atorvastatin group.Control group was given normal diet，and the rest groups were given high fat diet. After 4 weeks of high fat diet，atorvastatin group was continued to keep high fat diet and given drugs.The mice were observed for 16 weeks.Vasculopathy was analyzed by hematoxylin-eosin staining.Expression of CD4＋CD25＋Treg in peripheral blood was analyzed by flow cytometry.Concentration of TGF-β was analyzed by ELISA.Results①Hyperplasia of intima was observed in AS group，and the percentage of CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T cell was significantly lower than that of the control group（P＜0.01）.Atatorvastatin could significantly reduce the intimail thickness.The percentage of CD4＋CD25＋Treg／CD4＋T cell was significantly higher than that of AS group（P＜0.01）. Atorvastatin group and control group had no significant difference.②As group′s concentration of TGF-β was significantly lower than the control group（P＜0.01）.Atorvastatin group′s concentration of TGF-β was significantly higher than that of AS group（P＜0.01）.Atorvastatin group and control group had no significant difference.ConclusionOur date provides evidence to show CD4＋CD25＋Treg and autocrine secretion of TGF-β can inhibit the development of atherosclerosis，and they will be a new therapeutic target of atherosclerosis.

regulatory T cell；atherosclerosis；flow cytometry；atorvastatin

R 541.4

A

1000－1492（2015）07－0888－04

2015－02－09接收

安徽醫科大學第一附屬醫院博士啟動基金；安徽省高校省級自然科學研究重點項目（編號：KJ2011A158）

安徽醫科大學第一附屬醫院心血管內科，合肥 230022作者簡介：陳越峰，男，碩士研究生；周碧蓉，女，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zhoubirong1＠hotmail.com