乳源免疫調節肽對酒精誘導性肝細胞損傷的干預機制

劉 琛，雷 婷，周 娟，趙夢靜，秦宜德

乳源免疫調節肽對酒精誘導性肝細胞損傷的干預機制

劉 琛，雷 婷，周 娟，趙夢靜，秦宜德

目的研究乳源免疫調節肽（PGPIPN）對肝細胞酒精性脂肪變性的干預機制。方法MTT法篩選正常肝細胞株（LO2）酒精誘導的最佳濃度和PGPIPN最佳用藥范圍，在肝細胞內加入酒精和不同濃度的PGPIPN進行干預，連續造模3個月，建立能穩定遺傳的酒精誘導脂肪變性的肝細胞模型，觀察PGPIPN對肝細胞脂肪變性的防治效果。油紅O染色法觀察LO2細胞脂肪變性程度，RT-PCR法檢測脂肪合成相關基因（ACC、PPAR-γ）的表達。結果成功建立了能穩定遺傳的酒精誘導脂肪變性的肝細胞模型，并篩選出酒精誘導LO2脂肪變性的最佳濃度和PGPIPN最佳用藥范圍。PGPIPN可以防治和緩解脂肪變性，PGPIPN可能通過降低ACC的基因表達，升高PPAR-γ的基因表達來實現。結論PGPIPN可防治和放緩肝細胞酒精性脂肪病變，機制可能是減少脂肪合成。

PGPIPN；LO2；脂肪變性；脂肪合成

資料［1］顯示男性每日攝入乙醇＞40 g，女性每日攝入乙醇＞30 g，就有可能導致肝臟損傷，如果任其繼續發展，可能導致酒精性脂肪肝，甚至肝硬化。乳源免疫調節肽（immunomodulating peptide，PGPIPN）是最典型的免疫調節肽，是位于β-酪蛋白63 ～68殘基上的6個氨基酸殘基組成的短肽［2］。研究［3］顯示PGPIPN可以減輕酒精造模小鼠脂肪變性程度，延緩酒精肝發展。該研究通過酒精誘導脂肪變性的肝細胞模型，旨在探討PGPIPN對酒精性脂肪肝的防治作用及對受損后肝細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株人正常肝細胞株（LO2）由安徽醫科大學生物化學與分子生物學實驗室保存。

1.2 藥物與試劑PGPIPN購自上海楚肽生物科技有限公司，純度98.23%；MTT、DMEM培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自天津康源生物技術有限公司；RT-PCR試劑盒購自美國Fermentas公司。

1.3 方法

1.3.1 篩選酒精最佳濃度和PGPIPN用藥濃度用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照每孔6 000、4 000、2 000個細胞種植在96孔板上，細胞貼壁后第1組使用正常培養基DMEM作為正常對照組，后5組細胞的DMEM培養基分別加入不同濃度酒精（0.1%、0.25%、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%），每日換液分別培養24、48、72 h后在490 nm波長下測吸光度（optical density，OD）值。細胞抑制率（%）＝（對照組OD490－實驗組OD490）／對照組OD490× 100%。篩選酒精最佳濃度。再次分組第1組正常對照組使用正常培養基DMEM，第2組酒精對照組的DMEM培養基加入篩選好濃度的酒精，后5組實驗組的DMEM培養基除了含有酒精還加入不同濃度的PGPIPN（1×10－5、1×10－4、1×10－3、1×10－2、1×10－1g／L），連續培養LO2細胞1個月，在酒精對照組LO2細胞出現脂肪變性后，取各組對數期LO2細胞用胰蛋白酶消化，按照每孔6 000、4 000、2 000個細胞種植在96孔板上，分別培養24、48、72 h，在490 nm波長下測量各孔OD值，計算細胞存活率（%）＝（實驗組OD490／酒精對照組OD490）×100%，篩選出PGPIPN最佳作用濃度。

1.3.2 酒精性脂肪肝細胞模型的建立 篩選出酒精和PGPIPN最佳作用濃度后，將細胞分為：①正常對照組：DMEM培養；②酒精對照組：DMEM＋酒精培養；③低濃度PGPIPN組：DMEM＋酒精＋PGPIPN（1×10－4g／L）；④中濃度PGPIPN組：DMEM＋酒精＋PGPIPN（1×10－3g／L）；⑤高濃度PGPIPN組：DMEM＋酒精＋PGPIPN（1×10－2g／L）。以上各組均隔天換液，每4 d傳代，連續培養2個月后的細胞方可用于后續試驗。

1.3.3 油紅O染色 取不同組別連續刺激培養的LO2細胞，在6孔板爬片培養（玻片需提前泡酸、高壓滅菌），細胞匯合率達80%后，用胰蛋白酶消化成懸液，1 000 r／min離心5 min，PBS洗滌3次（60 s／次），4%多聚甲醛固定1 h，100%丙二醇洗滌2 min，避光條件下用0.5%的油紅O染色過夜，隔天用98%丙二醇洗滌5 min，85%丙二醇洗滌10 min，60%異丙醇脫色。蘇木精染色細胞核10 min，流水中藍化20 min，烘箱烘烤2 h，甘油明膠封片烘箱過夜，顯微鏡拍照。

1.3.4 RT-PCR法檢測相關基因表達 利用Primer 5.0軟件設計β-actin、乙酰輔酶A羧代酶（acetylcoA carboxylase，ACC）、過氧化物酶體增殖物活代受體γ（peroxisome proliferalors activated receptor gamma，PPAR-γ）引物序列，送至上海生工合成引物。使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，用Fermentas試劑盒逆轉錄為cDNA，加入引物PCR擴增。瓊脂糖電泳擴增產物，采集圖像進行光密度掃描，用目的基因與β-actin光密度比值衡量相應基因表達高低，重復3次試驗。引物序列見表1。

表1 β-actin、ACC、PPAR-γ引物序列、片段大小和退火溫度

1.4 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據用±s表示。組間計量資料采用成組設計的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 酒精誘導脂肪變性LO2細胞模型的建立與正常對照組比較，酒精組細胞抑制率均有上升，差異有統計學意義（P＜0.05），尤其是1.0%酒精刺激之后細胞抑制率明顯上升。表明隨著酒精濃度升高，細胞活性降低，細胞活性與酒精濃度成反比。選取0.5%的酒精濃度作為誘導LO2酒精性脂肪變性的最佳酒精濃度（F24 h＝158.708，F48 h＝113.605，F72 h＝176.690），見圖1。

2.2 PGPIPN對LO2細胞脂肪變性的防治作用

2.2.1 PGPIPN對酒精性脂肪變性LO2細胞存活率的影響 與正常對照組比較，各用藥組存活率均下降，除了酒精對照組和1×10－5g／L PGPIPN用藥組，其他差異均有統計學意義（P＜0.05）。與酒精對照組比較，加入不同濃度PGPIPN培養的酒精誘導變性肝細胞存活率均有上升，除了1×10－5g／L PGPIPN用藥組，其他差異均有統計學意義（P＜0.05），以1×10－2g／L最為明顯。細胞活性在一定范圍內隨著培養時間和PGPIPN上升而增高。因此選取1×10－4、1×10－3、1×10－2g／L作為PGPIPN最佳用藥濃度（F24 h＝7.417，F48 h＝7.773，F72 h＝8.591），見圖2。

2.2.2 PGPIPN對酒精性脂肪變性LO2細胞脂肪合成的影響 油紅O染色顯示正常對照組的肝細胞沒有紅色脂肪粒，胞質可出現少量未著色顆粒樣物質；酒精對照組染色后在靠近胞膜的位置出現大量紅色脂滴，出現“環狀”或者“印戒”樣細胞，各脂滴出現融合現象；而經過PGPIPN干預的酒精性脂肪變性肝細胞，隨著PGPIPN濃度升高出現脂滴減少、脂滴間融合現象減少，見圖3。

2.2.3 RT-PCR法檢測相關基因的變化 PGPIPN可以在脂肪合成方面（圖4）下調ACC mRNA，上調PPAR-γ mRNA，且隨著PGPIPN用藥時間延長和濃度增加更加明顯，用藥組與正常對照組比較差異有統計學意義，用藥組與酒精對照組比較差異也有統計學意義（FACC＝285.170、FPPAR-γ＝183.231，P＜0.05）。

3 討論

酒精性脂肪肝在歐美等國發病率較高，但是隨著國內生活水平和飲食習慣的改變，我國的酒精肝發病率也出現上升的趨勢。肝臟是酒精代謝主要場所，在酒精長期刺激下肝細胞容易出現脂肪變性，其可能的機制和脂肪代謝紊亂有關。

ACC在脂肪合成中起重要作用，是脂肪酸合成限速酶，其活性或基因表達增加可以促進脂肪合成［4］。本實驗證明酒精對照組的ACC表達量明顯增高；PGPIPN可以明顯下調ACC表達，且隨著PGPIPN濃度增大表達量下降更加顯著，說明在酒精的作用下，肝細胞脂肪合成增多，而PGPIPN可能通過下調ACC而減少脂質蓄積，改善脂肪變性。

PPAR-γ屬于PPAR 3種亞型之一，在脂肪組織高表達，正常肝臟里PPAR-γ表達量僅為脂肪組織的10%～30%，PPAR-γ可促進脂肪酸在肝臟的β-氧化，起到降脂作用。活化的PPAR-γ還能促進細胞分泌脂聯素，其能改善肝細胞對胰島素敏感性，脂聯素通過增強PPAR-α活性，也能促使脂肪酸β氧化，減少肝細胞脂肪堆積［5］。脂質過氧化會降低PPAR-γ表達，促進肝臟三酰甘油蓄積，加重肝臟脂肪變性，促進脂肪肝形成［6］。PPAR-γ具有促進酒精性脂肪肝細胞的分化，其活化后使轉運至肌肉和肝臟的脂肪酸減少，脂肪合成降低，防止脂肪堆積［7］。該實驗的酒精對照組脂肪變性嚴重，PPAR-γ表達量明顯降低，相反PGPIPN用藥組PPAR-γ表達量較酒精對照組有上升趨勢，且具有濃度依賴性，肝細胞脂肪變性減輕。提示PGPIPN可能通過激活PPAR-γ促進肝細胞β-氧化，減少脂質蓄積，改善肝細胞脂肪變性。

正常肝細胞經過長期酒精誘導后脂肪生產增多，β-氧化減弱，脂肪酸清除減緩，脂肪堆積，造成PPAR-γ表達減弱，發生脂肪變性，而PGPIPN可以緩解酒精對PPAR-γ的抑制作用，改善酒精性脂肪變性。

酒精性脂肪肝發病機制復雜，目前沒有專門藥物，主要防治手段包括戒酒、清淡飲食和加強鍛煉。小分子肽具有抗腫瘤、抗疲勞、增強抵抗力等多重作用，所以本實驗選用PGPIPN作用于體外酒精性脂肪肝，結果顯示PGPIPN組油紅O染色脂肪合成減少，同時RT-PCR顯示ACC mRNA表達下降，PPAR-γ mRNA表達上升。可能的機制是通過降低ACC表達、激活PPAR-γ表達，減少脂肪合成，減輕脂肪變性，從而達到防治和緩解酒精性脂肪肝病變的目的，但其具體機制有待進一步研究。

［1］ 鄭睿行，馬 力.免疫調節肽的概述［J］.生命科學儀器，2008，6（10）：9－12.

［2］ Wang W，Gu F，Wei C，et al.PGPIPN，a therapeutic hexapeptide，suppressed human ovarian cancer growth by targeting BCL2 ［J］.PLoS One，2013，8（4）：e60701.

［3］ 楊浩然，魏彩，唐宜桂，等.乳源免疫調節肽對小鼠酒精性脂肪肝的防治作用［J］.安徽醫科大學學報，2013，48（4）：336－40.

［4］ 彭麗紅，陽學鳳，傅 念，等.姜黃素對脂肪變性HL-7702細胞乙酰輔酶A羧化酶表達的影響［J］.中華肝臟病雜志，2008，16 （12）：948－9.

［5］ Yamauchi T，Kamon J，Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptors that mediate antidiabetic metabolic effects［J］.Nature，2003，423（6941）：762－9.

［6］ Seo Y S，Kim J H，Jo N Y，et al.PPAR agonists treatment is effective in a nonalcoholic fatty liver disease animal model by modulating fatty-acid metabolic enzymes［J］.J Gastroenterol Hepatol，2008，23（1）：102－9.

［7］ Eeric R K，Alan M，Scott J C.Role of peroxisome proliferatorsactivated receptors in the pathogenesis and treatment of nonalcoholic fatty liver disease［J］.World J Gastroenterol，2008，14（1）：22 －8.

The effect and the mechanism of immunomodulating peptide on alcoholic fatty liver cells model

Liu Chen，Lei Ting，Zhou Juan，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo explore the effect of immunomodulating peptide（PGPIPN）on mechanism on alcoholic fatty liver cells model induced in vitro in human.MethodsThe liver cells（LO2）proliferation with the optima concentration of alcohol and PGPIPN in vitro were assayed by MTT method.Liver cells were treated with alcohol and different concentrations of PGPIPN for 3 months，then stable model of alcoholic fatty liver cells were established with screening concentration，aiming to observing the prevention and mitigation effects of PGPIPN on alcoholic fatty liver cell.Oil Red O staining was used to detect the degree of LO2cells steatosis.The expressions of genes of fat synthesis related genes（ACC，PPAR-γ）were tested by RT-PCR.ResultsAn alcohol induced fatty liver cells model was established successfully.The best concentration of alcohol and PGPIPN was already screened.PGPIPN could prevent and mitigate alcoholic fatty degeneration of the liver cells.The mechanism may be associated with decreasing expression of ACC（mRNA）and increasing expression of PPAR-γ（mRNA）induced by PGPIPN.ConclusionPGPIPN can reduce alcoholic fatty degeneration of the liver cells，which may relate to slow fat synthesis.

PGPIPN；LO2；steatosis；fat synthesis

R 332；R 392.11；R 392.12

A

1000－1492（2015）07－0892－04

2015－03－16接收

國家自然科學基金（編號：81472448）

安徽醫科大學生物化學與分子生物學教研室，合肥230032

劉 琛，女，碩士研究生；秦宜德，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：qinyide＠hotmail.com