SPATA22基因多態性與中國漢族非梗阻性無精子癥的易感性關聯分析

查 醒，賀小進，2，宋 兵，杜衛東，張 妍，阮 健，吳 歡，曹云霞，2

SPATA22基因多態性與中國漢族非梗阻性無精子癥的易感性關聯分析

查 醒1，賀小進1，2，宋 兵1，杜衛東3，張 妍3，阮 健3，吳 歡1，曹云霞1，2

目的探討精子發生相關基因22（SPATA22）基因的7個標簽單核苷酸多態性（SNP）位點多態性與中國漢族非梗阻性無精子癥（NOA）的易感性的相關性。方法選取368例已生育的男性（對照組）和361例NOA患者（病例組），應用Sequenom MassArray質譜陣列技術檢測對照組和病例組SPATA22基因7個標簽SNPs的基因型。應用Plink 1.07軟件及Haploview軟件對數據資料進行統計分析，比較對照組與病例組SPATA22基因的最小等位基因頻率（MAF）基因型及單體型的差異。結果SPATA22基因7個標簽SNPs的MAF、基因型及單體型在對照組與病例組間差異無統計學意義（P＞0.05）。結論SPATA22基因7個標簽SNPs位點多態性與中國漢族男性NOA的易感性可能不相關。

不育癥；非梗阻性無精子癥；SPATA22基因；單核苷酸多態性

全球不孕癥的患病率約為10%，其中男方因素約占一半［1］。目前多數男性不育發病機制尚不明確，稱為特發性不育癥［2］。非梗阻性無精子癥（non －obstructive azoospermia，NOA）是臨床上常見的、嚴重的不育癥之一，雖然小部分NOA患者可通過卵細胞胞質內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）獲得自己的生物學后代，但ICSI繞過自然選擇，一些遺傳異常可能會傳至子代［3－7］。因此，深入研究NOA的分子機制有利于子代人口健康。精子發生相關基因22（spermatogenesis associated 22，SPATA22）是在脊椎動物中新發現的一個保守基因，位于人類第17號染色體［8］。研究［8－10］證明，SPATA22基因是生殖細胞減數分裂早期的關鍵基因，其突變可導致不育癥。SPATA22基因在精子發生過程中發揮重要作用，該研究探討SPATA22基因多態性與中國漢族男性NOA發生的相關性。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2008年3月～2014年3月于安徽醫科大學第一附屬醫院生殖醫學中心男科門診就診的NOA患者361例作為病例組。入選標準：NOA患者均行≥3次精液離心檢查，未見精子（參照第5版WHO人類精液分析技術手冊）［11］，行睪丸組織病理檢查顯示睪丸生精功能減退、阻滯或唯支持細胞綜合征。排除標準：①染色體核型分析異常；②Y染色體微缺失；③附睪飽滿或存在結節；④隱睪、睪丸炎、精索靜脈曲張、腹股溝疝、輸精管結扎等病史。選擇同期有正常生育史，精液檢查正常，排除生殖道疾病，因女方不孕因素就診于我中心的男性共368例作為對照組。采集所有研究對象的外周靜脈血3～4 ml，置于5 ml的EDTA抗凝管中，－80℃保存待統一測定。研究對象之間均無親緣關系且均為漢族人。本研究獲得安徽醫科大學倫理委員會批準（2008035），且所有入選對象簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取和標準化 按照德國QIAGEN公司的基因組DNA提取試劑盒（51306）使用說明書進行操作，提取樣本基因組DNA后電泳，檢測濃度后，標準化至15～20 ng／μl，－80℃保存備用。

1.2.2 SNP點選擇 本研究依據國際人類單倍體圖計劃網站（http：／／hapmap.ncbi.nlm.nih.gov／）提供的基因型，運用Haploview軟件及前人研究篩選SPATA22基因7個標簽SNPs，分別為：rs1488689、rs1488690、rs2171582、rs7209613、rs2291604、rs17822627、rs9901726。要求最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）≥0.05。PCR擴增及延伸產物由Sequenom MassArray Assay Designer 3.0軟件設計并由Invitrogen（上海）基因技術有限公司合成，見表1。

表1 SPATA22基因7個SNPs位點引物序列

1.2.3 基因分型 利用Sequenom MassArray質譜陣列技術對7個標簽SNPs位點進行基因分型。參考Han et al［12］報道的方法，具體步驟如下：利用多重PCR反應擴增DNA樣本，進行單堿基延伸反應，將所得產物除去鹽分，轉移到384孔板的PCR儀上；采用基質輔助激光解吸質譜儀（MALDI-TOF MS）檢測等位基因，用MassArray Typer軟件分析質譜圖［13－14］。

1.3 統計學處理應用Plink 1.07軟件進行分析和質控，檢測對照組和病例組數據是否符合Hardy-Weinberg平衡定律，7個標簽SNPs位點的樣本檢測率均需＞90%。比較病例組與對照組7個SNPs位點的等位基因頻率，采用兩獨立樣本t檢驗計算P值、95%可信區間（confidence interval，CI）、優勢比（odds ratio，OR）以及分析7個標簽SNPs位點的基因型。進一步利用Haploview軟件分析7個標簽SNPs位點的單體型。

2 結果

2.1 研究對象一般資料病例組雙側睪丸體積均顯著小于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 病例組與對照組一般臨床資料（±s）

表2 病例組與對照組一般臨床資料（±s）

項目對照組（n＝368）病例組（n＝361）P值體質量指數（kg／m2）23.01±3.1122.91±2.950.071右側睪丸體積（ml）14.58±2.658.90±3.510.000左側睪丸體積（ml）14.51±2.708.95±3.550.000精子濃度（×106／ml）85.84±53.45－－前向運動精子（%）56.51±9.99－－

2.2 SPATA22基因SNPs與NOA發病風險的關系SPATA22基因的7個標簽SNPs位點的相關信息及MAF見表3，病例組與對照組間的各MAF分布差異無統計學意義（P＞0.05）。進一步分析7個位點的基因型顯示，病例組及對照組各位點基因型的分布差異亦無統計學意義（P＞0.05），見表4。

2.3 SPATA22基因單體型分析分析7個標簽SNPs位點的單體型，顯示病例組和對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

3 討論

至少有400種不同的基因參與男性精子發生過程。這些基因本身的變異或者其表達產物、功能的改變會影響男性正常精子生成，導致精子發生障礙［15］。研究［3－7］表明，基因突變或易感性在先天性男性不育中起著重要的作用，一些基因與男性精子發生障礙密切相關。減數分裂是配子形成過程的決定性事件，兩性生殖細胞經過減數分裂形成單倍體配子細胞，才有胚胎的形成和發展。如果減數分裂過程受阻，常常會導致不孕或者非整倍體配子的出現［8］。同源染色體的配對、重組和聯會是減數分裂的標志。研究［8－9］證明，SPATA22是減數分裂早期必不可少的關鍵基因，其突變可導致雄性和雌性生殖細胞中相應的轉錄物和蛋白的表達受限，兩性生殖細胞的發育停滯在減數分裂早期并且逐漸丟失。從而致使減數分裂時期無法正常聯會，DNA雙螺旋的斷裂修復受阻。La Salle et al［8］發現SPATA22基因調控的蛋白主要表達于精母細胞中，其轉錄物存在于整個睪丸發育過程中。使用N-乙基-N-亞硝基脲誘導SPATA22基因突變小鼠，顯示雄性及雌性小鼠均出現了不孕不育的表型。雄性突變體小鼠表現為生精障礙以及完全的缺少精子細胞，突變小鼠減數分裂過程中染色體不聯會情況增加，遺傳重組位點減少。研究［9］顯示，在SPATA22基因缺失的突變大鼠中，SPATA22蛋白調控著DNA斷裂雙鏈上RAD51蛋白參與的DNA修復過程受阻，其缺失引起了減數分裂重組的失敗，導致了生精障礙。提示SPATA22基因突變可能與先天性雄性不育的發生相關。Aston et al［10］在2010年的一項對歐洲男性人群的全基因組SNP關聯分析中檢測了3個SPATA22基因的SNP位點（rs2291604、rs12602543、rs1488690），發現其變異可能與嚴重少精子癥及NOA無關。但是在其他人群中尚無此研究。

表3 SPATA22基因7個標簽SNPs位點相關信息及MAF

表4 病例組與對照組SPATA22基因7個標簽SNPs位點基因型分析（%）

表5 SPATA22基因單體型分析（%）

本研究首次檢測中國漢族NOA患者和正常生育對照者SPATA22基因7個標簽SNPs（rs1488689、rs1488690、rs2171582、rs7209613、rs2291604、rs17822627、rs9901726）的基因型分布特點，結果顯示所選取的7個標簽SNPs與漢族男性NOA的易感性可能不相關。進一步的基因型及單體型分析也顯示在病例組與對照組間差異無統計學意義，與研究［10］結果相似。推測可能的原因有：①NOA的發病機制十分復雜，SPATA22基因可能與本組實驗的研究對象的發病無關；②本研究中選取的7個標簽SNPs可能并沒有覆蓋到SPATA22基因真正易感的SNP位點；③在動物實驗中可以獲得誘導后的突變體，而在人類的研究中很難發現類似個體。

綜上所述，SPATA22基因7個標簽位點的多態性可能與中國漢族男性NOA的發生不相關。SPATA22基因與中國漢族男性NOA發生的關系以及發病中作用機制仍有待進行多中心、大樣本、多種族的人群調查，以及長期前瞻性研究。可以研究SPATA22基因編碼區和非編碼區的直接測序、SPATA22表觀遺傳學特點以及深入的功能試驗，進一步探索SPATA22在人類精子發生中的作用。

［1］ Dyer S J.International estimates on infertility prevalence and treatment seeking：potential need and demand for medical care［J］. Hum Reprod，2009，24（9）：2379－80.

［2］ Nuti F，Krausz C.Gene polymorphisms／mutations relevant to abnormal spermatogenesis［J］.Reprod Biomed Online，2008，16 （4）：504－13.

［3］ Hu Z，Xia Y，Guo X，et al.A genome-wide association study in Chinese men identifies three risk loci for non-obstructive azoospermia［J］.Nat Genet，2011，44（2）：183－6.

［4］ He X J，Ruan J，Du W D，et al.PRM1 variant rs35576928（Arg ＞Ser）is associated with defective spermatogenesis in the Chinese Han population［J］.Reprod Biomed Online，2012，25（6）：627 －34.

［5］ Ruan J，He X J，Du W D，et al.Genetic variants in TEX15 gene conferred susceptibility to spermatogenic failure in the Chinese Han population［J］.Reprod Sci，2012，19（11）：1190－6.

［6］ He X J，Song B，Du W D，et al.CREM variants rs4934540 and rs2295415 conferred susceptibility to nonobstructive azoospermia risk in the Chinese population［J］.Biol Reprod，2014，91（2）：52.

［7］ Song B，He X J，Du W D，et al.Genetic study of Hormad1 and Hormad2 with non-obstructive azoospermia patients in the male Chinese population［J］.J Assist Reprod Genet，2014，31（7）：873－9.

［8］ La Salle S，Palmer K，O′Brien M，et al.SPATA22，a novel vertebrate-specific gene，is required for meiotic progress in mouse germ cells［J］.Biol Reprod，2012，86（2）：45.

［9］ Ishishita S，Matsuda Y，Kitada K.Genetic evidence suggests that SPATA22 is required for the maintenance of Rad51 foci in mammalian meiosis［J］.Sci Rep，2014，4：6148.

［10］Aston K I，Krausz C，Laface I，et al.Evaluation of 172 candidate polymorphisms for association with oligozoospermia or azoospermia in a large cohort of men of European descent［J］.Hum Reprod，2010，25（6）：1383－97.

［11］Cooper T G，Noonan E，von Eckardstein S，et al.World Health Organization reference values for human semen characteristics［S］. Hum Reprod Update，2010，16（3）：231－45.

［12］Han J W，Zheng H F，Cui Y，et al.Genome-wide association study in a Chinese Han population identifies nine new susceptibility loci for systemic lupus erythematosus［J］.Nat Genet，2009，41 （11）：1234－7.

［13］彭玉婉，賀小進，阮 健，等.PRDM9基因多態性與漢族男性精子發生障礙相關性研究［J］.生殖與避孕，2012，32（6）：377.

［14］宋 兵，賀小進，姚嗣會，等.轉錄因子Ets差異基因（ETV5）基因多態性與非梗阻性無精子癥相關性研究［J］.生殖與避孕，2014，34（3）：187.

［15］O′Bryan M K，de Kretser D.Mouse models for genes involved in impaired spermatogenesis［J］.Int J Androl，2006，29（1）：76－89.

Relationship of SPATA22 gene variants with non-obstructive azoospermia in Chinese Han population

Zha Xing1，He Xiaojin1，2，Song Bing1，et al
（1The Reproductive Medicine Center，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，2Biopreservation and Artifical Organs Anhui Provinvial Engineering Research Center，Hefei 230022）

ObjectiveTo investigate the relationship of SPATA22 gene polymorphism with the risk of non-obstructive azoospermia（NOA）in Chinese Han population.MethodsA total of 361 cases with idiopathic NOA and 368 males with normal fertility were collected.The genotypes distribution of seven single nucleotide polymorphisms （SNPs）in SPATA22 were detected using Sequenom MassArray technique.Allele frequencies and genotype analysis between the control group and the case group were compared by using Plink 1.07 software.Haplotype analysis was studied by Haploview Software.ResultsBetween the case group and the control group，there was no significant difference in the allele frequencies of the seven SNPs（P＞0.05）and no difference was observed between the case group and the control group in haplotype analysis（P＞0.05）.ConclusionThe seven SNPs of SPATA22 may not be associated with NOA in Chinese Han population.

stertility；non-obstructive azoospermia；SPATA22 gene；single nucleotide polymorphism

R 698.2

A

1000－1492（2015）07－0900－04

2015－03－13接收

國家自然基金（編號：81300538）

安徽醫科大學1第一附屬醫院生殖醫學中心、3省部共建重要遺傳病基因資源利用重點實驗室，2安徽省生命資源保存與人工器官工程技術研究中心，合肥 230022

查 醒，女，碩士研究生；曹云霞，女，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：caoyunxia6＠126.com；杜衛東，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：weidongdu＠hotmail.com