青蒿琥酯對高糖誘導的腎小管上皮細胞TLR4、NF-κB表達及合成的影響

蔣姍姍，龍 艷，蘇 珂，聶 寒，楊 帆，鄭天鵬，莫如芬

青蒿琥酯對高糖誘導的腎小管上皮細胞TLR4、NF-κB表達及合成的影響

蔣姍姍，龍 艷，蘇 珂，聶 寒，楊 帆，鄭天鵬，莫如芬

目的探討青蒿琥酯（Art）對高糖誘導下的大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）Toll樣受體4（TLR4）、核轉錄因子-κB（NF-κB）表達及合成的影響。方法體外培養NRK-52E細胞，分為6組：正常對照組、高糖組、Art小劑量組、Art中劑量組、Art高劑量組、依那普利組。培養48 h后收集各組細胞，采用逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測細胞TLR4、NF-κB mRNA含量；采用Western blot法檢測細胞TLR4、NF-κB蛋白表達水平。結果①與正常對照組比較，高糖組細胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）；②與高糖組比較，Art小、中、高劑量組細胞TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達水平明顯降低，且呈劑量依賴性（P＜0.05）；③與依那普利組比較，Art小、中、高劑量組細胞TLR4水平表達均升高，且Art高劑量組與依那普利組差異無統計學意義。與依那普利組比較，Art小、中劑量組細胞NF-κB水平表達升高，Art高劑量組細胞NF-κB水平表達降低，且Art中、高劑量組與依那普利組差異無統計學意義。結論Art可呈劑量依賴性地抑制高糖環境下NRK-52E細胞TLR4、NF-κB的高表達及合成。

糖尿病腎病；青蒿琥酯；腎小管上皮細胞；Toll樣受體4；核轉錄因子-κB

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）本質上是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應和促炎癥細胞因子在DN的發展中起著決定性作用［1］。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）是一個主要分布于炎癥細胞表面的受體超家族，其中TLR4（Toll-like receptor-4，TLR4）主要分布在腎組織，可通過激活核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）而引起腫瘤壞死因子α、白細胞介素8等前炎癥因子的表達增加，誘導炎癥反應的發生［2］，同時炎癥因子又可進一步激活NF-κB，從而誘發炎癥信號不斷放大［3］。青蒿琥酯（artesunate，Art）是我國傳統中藥青蒿素的一種水溶性衍生物，是治療瘧疾的經典藥物［4］，研究［5］顯示其對多種炎癥性病理模型如佐劑性關節炎大鼠、哮喘大鼠［6］具有明顯的抗炎和免疫調節作用，已證實其可減輕腎間質炎性損傷［7］，但Art是否對腎小管上皮細胞TLR4及NF-κB的表達存在影響，目前鮮有文獻報道。該實驗以大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E為模型，觀察高糖及Art對腎小管細胞TLR4、NF-κB水平的影響，為Art應用于DN防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞來源 NRK-52E購自上海復祥生物科技有限公司（源于ATCC，貨號CRL-1571）。

1.1.2 主要藥物與試劑 注射用Art（桂林南藥股份有限公司，批號LA130613）；馬來酸依那普利原料藥（武漢勝天宇生物科技有限公司）；低糖、高糖DMEM培養基（美國Gibco公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq Master Mix、DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；PCR引物由Invitrogen（上海）貿易有限公司設計合成；WIP組織細胞裂解液、（北京博奧森生物技術有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；SDSPAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜（北京索萊寶科技有限公司）；預染蛋白Marker（美國Thermo公司）；兔抗鼠TLR4多克隆抗體（美國Affinity公司）；兔抗鼠NF-κB p65多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體（杭州賢至生物科技有限公司）；辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；Super ECL Plus超敏發光液（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.2 細胞培養與分組

1.2.1 細胞培養 NRK-52E用含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml鏈霉素的低糖DMEM培養基（D-葡萄糖濃度5.6 mmol／L）于37℃、5% CO2無菌培養箱中孵育。細胞呈單層貼壁生長，長至80%左右用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3傳代培養，每2～3 d傳代1次。取第5～10代細胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 細胞生長至亞融合狀態時加入無血清低糖DMEM培養基，同步化24 h，根據預實驗篩選的藥物濃度，將NRK-52E細胞分為6組：①正常對照組：低糖DMEM培養基（D-葡萄糖終濃度5.6 mmol／L）；②高糖組：高糖DMEM培養基（D-葡萄糖終濃度25 mmol／L）；③Art小劑量組：高糖DMEM培養基＋Art（終濃度10 mg／L）；④Art中劑量組：高糖DMEM培養基＋Art（終濃度20 mg／L）；⑤Art高劑量組：高糖DMEM培養基＋Art（終濃度30 mg／L）；⑥依那普利組：高糖DMEM培養基＋依那普利（終濃度5 mg／L）。

1.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測NRK-52E細胞中TLR4、NF-κB mRNA表達細胞按上述分組加藥處理48 h后，提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度后，將總RNA逆轉錄成cDNA后進行擴增。PCR反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性3 s，退火30 s（各目的引物的引物序列及退火溫度見表1），72℃延伸1 min，循環31次，72℃延伸5 min。取PCR產物6 μl，以濃度為1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg／L溴化乙啶）電泳，用SensiAnsys凝膠成像系統攝影并定量分析，計算名組目的基因與內參基因光密度值的比值。

表1 RT-PCR引物序列及反應條件

1.4 Western blot法檢測NRK-52E細胞中TLR4、NF-κB p65蛋白表達細胞按上述分組加藥處理48 h后，提取各組細胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，取30 μg蛋白樣品加入上樣緩沖液，95℃水煮變性5 min后，進行10%SDS-PAGE凝膠變性電泳，然后轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉2 h，加入一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶200）、GAPDH（1∶1 000），搖床4℃孵育過夜。TBST洗膜后加辣根酶標記二抗（1∶5 000），搖床室溫孵育2 h，TBST洗膜后加適量發光液暗室發光，曝光后在SensiAnsys凝膠成像系統下拍照并獲取灰度值，以相應目的蛋白條帶與內參蛋白條帶的灰度比值計算名組蛋白的相對表達量。

1.5 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，所有實驗均重復3次，數據以±s表示。多個樣本之間的比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。

2 結果

2.1 高糖和Art對NRK-52E細胞TLR4、NF-κB mRNA表達的影響RT-PCR結果顯示，各組加藥處理48 h后，正常對照組細胞中TLR4、NF-κB mRNA的表達呈較低水平，高糖組水平明顯升高（P＜0.05）；而Art小、中、高劑量組和依那普利組水平明顯低于高糖組，但仍高于正常對照組（FTLR4＝273.475、FNF-κB＝80.641，P＜0.01），且Art中、高劑量組較Art小劑量組下調效應更加顯著（P＜0.05）。Art小、中、高劑量組TLR4 mRNA表達水平較依那普利組升高，且Art高劑量組與依那普利組差異無統計學意義（P＞0.05）。Art小、中劑量組NF-κB mRNA表達水平較依那普利組升高，而Art高劑量組的水平較依那普利組降低，且Art中、高劑量組與依那普利組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

表2 各組細胞TLR4、NF-κB mRNA表達（n＝3，±s）

表2 各組細胞TLR4、NF-κB mRNA表達（n＝3，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與高糖組比較：＃P＜0.05；與Art小劑量組比較：△P＜0.05；與Art中劑量組比較：▽P＜0.05

組別TLR4／β-actinNF-κB／β-actin正常對照0.096±0.0120.075±0.010高糖0.670±0.024*0.870±0.039*Art小劑量0.451±0.013*＃0.684±0.024*＃Art中劑量0.358±0.045*＃△0.507±0.060*＃△Art高劑量0.183±0.008*＃△▽0.347±0.054*＃△▽依那普利0.166±0.010*＃△▽0.446±0.090*＃△

2.2 高糖和Art對NRK-52E細胞TLR4、NF-κB p65蛋白表達的影響Western blot結果顯示，各組加藥處理48 h后，與正常對照組比較，高糖組細胞TLR4、NF-κB p65蛋白的表達明顯增高（P＜0.05）；與高糖組比較，Art小、中、高劑量組和依那普利組細胞TLR4、NF-κB p65蛋白的表達均降低，但仍高于正常對照組（FTLR4＝76.482、FNF-κB＝97.262，P＜0.01），且Art中、高劑量組較Art小劑量組下調效應更加顯著（P＜0.05）。Art小、中、高劑量組TLR4蛋白表達水平較依那普利組升高，且Art高劑量組與依那普利組差異無統計學意義（P＞0.05）。Art小、中劑量組NF-κB p65蛋白表達水平較依那普利組升高，而Art高劑量組的水平較依那普利組降低，且Art中、高劑量組與依那普利組差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

表3 各組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達（n＝3，±s）

表3 各組細胞TLR4、NF-κB蛋白表達（n＝3，±s）

與正常對照組比較：*P＜0.05；與高糖組比較：＃P＜0.05；與Art小劑量組比較：△P＜0.05；與Art中劑量組比較：▽P＜0.05

組別TLR4／GAPDHNF-κB／GAPDH正常對照0.061±0.0130.026±0.005高糖0.816±0.107*0.636±0.060*Art小劑量0.592±0.053*＃0.408±0.045*＃Art中劑量0.414±0.055*＃△0.271±0.024*＃△Art高劑量0.230±0.014*＃△▽0.147±0.013*＃△▽依那普利0.242±0.013*＃△▽0.193±0.047*＃△

3 討論

DN是一種進行性發展的疾病，高血糖和炎癥反應是DN發生、發展的關鍵因素［8］。目前治療DN的藥物很多都是通過抗炎治療的，其中血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI）是目前在DN治療中應用時間最長的藥物，有很好的腎臟保護作用，其可通過多種機制抑制DN炎癥反應，故本研究采用依那普利作為陽性對照藥物。

TLR是參與免疫炎癥反應、介導慢性炎性疾病的重要因素，其中包括糖尿病及其慢性并發癥。TLR4受體是發現最早的TLR亞型之一，在腎臟固有細胞如腎小管上皮細胞、系膜細胞能特異性地識別病原相關分子模式，通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號導入細胞內，啟動包括髓樣分化蛋白88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴性及非MyD88依賴性信號轉導途徑，使轉錄因子NF-κB活化［9］。NF-κB是體內重要的轉錄因子，通常以p50和p65組成的異源二聚體的形式存在于細胞內，在多種轉錄過程中發揮關鍵作用。在靜息狀態下，NF-κB二聚體與抑制性蛋白質IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）結合，存在于細胞質內。IκB蛋白受IκB激酶調控，當細胞受到氧化應激或炎性細胞因子等信號刺激時，IκB激酶逐步被激活，導致IκB蛋白發生磷酸化、泛素化和降解，而解離后的NF-κB二聚體則轉移到細胞核，結合特定的DNA序列，并激活靶基因的轉錄［10］。激活的NF-κB能調控多種炎癥細胞因子、趨化因子、黏附因子的轉錄，在免疫炎癥反應、細胞生長等方面起重要作用。國內現已有許多研究表明，TLR4／NF-κB信號通路在DN的發生發展過程中起著十分重要的作用。研究［11］顯示，DN患者腎組織中TLR4及相關炎性因子的表達顯著升高。章超群等［12］的動物實驗發現，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠模型腎組織中TLR信號通路蛋白TLR2、TLR4、MyD88與NF-κB p65表達明顯高于正常組。顧俊菲等［13］的體外實驗顯示，高糖培養的大鼠腎小球系膜細胞NF-κB表達合成較正常糖組顯著增高。本研究結果也顯示，高糖誘導后大鼠腎小管細胞中TLR4和NF-κB的表達均升高，與研究［14］結果一致。

Art是經典的抗瘧藥物，近年來研究［6，15］顯示Art可通過下調TLR4和NF-κB的表達來發揮抗炎和免疫調節的作用。本實驗結果顯示，用不同濃度Art干預高糖培養的大鼠腎小管上皮細胞后，TLR4、NF-κB mRNA和蛋白的表達水平均較高糖組明顯下降，且Art濃度越高，下調作用越明顯，呈現出明顯劑量依賴性，從一定程度可說明Art可抑制DN的炎癥反應。由于本實驗只觀察了各組細胞加藥處理后48 h的變化，是否存在時間依賴性仍需進一步研究。此外，本實驗顯示Art高劑量組與依那普利組TLR4水平差異無統計學意義，Art中、高劑量組與依那普利組NF-κB水平差異無統計學意義，說明適當劑量的Art在下調TLR4／NF-κB炎性信號通路方面可與ACEI類藥物依那普利達到同樣的效果。

綜上所述，本研究結果顯示Art可以降低高糖誘導的NRK-52E細胞中TLR4和NF-κB表達，該作用可能與腎臟保護有關，但Art作用于TLR4／NF-κB炎性信號通路的具體機制尚不明確，有待進一步研究。

［1］ Navarro-González J F，Mora-Fernández C，Muros de Fuentes M，et al.Inflammatory molecules and pathways in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Nat Rev Nephrol，2011，7（6）：327－40.

［2］ Li J，Jin C，Cleveland J C Jr，et al.Enhanced inflammatory responses to toll-like receptor 2／4 stimulation in type 1 diabetic coronary artery endothelial cells：the effect of insulin［J］.Cardiovasc Diabetol，2010，9：90.

［3］ Li M，Yu L，She T，et al.Astragaloside IV attenuates Toll-like receptor 4 expression via NF-κB pathway under high glucose condition in mesenchymal stem cells［J］.Eur J Pharmacol，2012，696 （1－3）：203－9.

［4］ Nzila A，Al-Zahrani I.Drugs for the treatment of malaria in the Kingdom of Saudi Arabia［J］.Saudi Med J，2013，34（6）：569－78.

［5］ 莫漢有，王麗芳，張麗華.青蒿琥酯對佐劑性關節炎大鼠血清及滑膜細胞培養上清液中腫瘤壞死因子α及趨化因子的影響［J］.中國中西醫結合雜志，2012，32（2）：253－6.

［6］ 黃發軍，詹光杰，張 宏.青蒿琥酯對哮喘大鼠肺組織TLR-4 及TGF-β1表達的影響［J］.中國醫藥生物技術，2011，6（4）：266－9.

［7］ 馬行一，吳蔚樺，曾 燕，等.青蒿琥酯對UUO模型大鼠腎臟的抗炎作用及其機制研究［J］.重慶醫學，2010，39（12）：1514 －6.

［8］ Yang S M，Ka S M，Wu H L，et al.Thrombomodulin domain 1 ameliorates diabetic nephropathy in mice via anti-NF-κB／NLRP3 inflammasome-mediated inflammation，enhancement of NRF2 antioxidant activity and inhibition of apoptosis［J］.Diabetologia，2014，57（2）：424－34.

［9］ Liu P，Li F，Qiu M，et al.Expression and cellular distribution of TLR4，MyD88，and NF-κB in diabetic renal tubulointerstitial fibrosis，in vitro and in vivo［J］.Diabetes Res Clin Pract，2014，105 （2）：206－16.

［10］Mutt S J，Karhu T，Lehtonen S，et al.Inhibition of cytokine secretion from adipocytes by 1，25-dihydroxyvitamin D3 via the NF-κB pathway［J］.FASEB J，2012，26（11）：4400－7.

［11］秦寧寧，王秋月.TLR4及相關炎性因子在糖尿病腎病中的表達及臨床意義［J］.中國老年學雜志，2014，34（13）：3648－9.

［12］章超群，武曉旭，吳永貴，等.白芍總苷對糖尿病大鼠腎組織Toll樣受體信號通路調節的研究［J］.中國藥理學通報，2014，30（3）：354－9.

［13］顧俊菲，葉山東，汪 姍，等.二甲雙胍對大鼠腎小球系膜細胞NF-κB、MCP-1、ICAM-1表達及合成的影響［J］.安徽醫科大學學報，2014，49（5）：582－5.

［14］劉抗寒，周巧玲，敖 翔，等.高糖對腎小管上皮細胞Toll樣受體4表達的影響［J］.中國醫師雜志，2010，12（1）：63－7.

［15］孫京華，王 慧，張煜昭，等.青蒿琥酯對大鼠角膜新生血管的影響［J］.眼外傷職業眼病雜志，2007，29（3）：172－5.

Effects of artesunate on expression and synthesis of Toll-like receptor 4 and nuclear factor-κB in renal tubular epithelial cells induced by high glucose

Jiang Shanshan，Long Yan，Su Ke，et al
（Dept of Endocrinology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541004）

ObjectiveTo explore the effects of artesunate（Art）on expression and synthesis of Toll-like receptor-4（TLR4）and nuclear factor-κB（NF-κB）in rat renal tubular epithelial cells（NRK-52E）induced by high glucose.MethodsNRK-52E cells were cultured and divided into six groups：normal control group，high glucose group，Art in low dose group，Art in medium dose group，Art in high dose group，and Enalapril group.Cells were collected after 48 hours.The expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein levels were detected by RTPCR and Western blot.Results①Compared with the normal control group，the expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein in high glucose group gradually increased（P＜0.05）；②Compared with the high glucosegroup，as increases in Art doses，the expressions of TLR4 and NF-κB at mRNA and protein in the Art in low，medium and high dose groups gradually reduced（P＜0.05）；③Compared with the Enalapril group，the expressions of TLR4 mRNA and protein in the Art in low，medium and high dose groups increased，and the difference between the Art in high dose group and the Enalapril group had no statistical significance（P＞0.05）.Compared with the Enalapril group，the expressions of NF-κB mRNA and protein in the Art in low and medium dose groups increased，but decreased in the Art in high dose group.Furthermore，there was no statistical difference in the Art in medium and high dose groups when compared with the Enalapril group（P＞0.05）.ConclusionArt can suppress the high expression and synthesis of TLR4 and NF-κB of NRK-52E cells induced by high glucose in a dose-dependent manner.

diabetic nephropathy；artesunate；renal tubular epithelial cells；toll-like receptor-4；nuclear factor-κB

R 587.1；R 692.6

A

1000－1492（2015）07－0904－05

2015－03－20接收

廣西醫療衛生適宜技術研究與開發項目（編號：S201316-07）；廣西自然科學基金項目（編號：2012GXNSFAA053085）；廣西高等學校計劃科研項目（編號：201204LX245）

桂林醫學院附屬醫院內分泌科，桂林 541004

蔣姍姍，女，碩士研究生；龍 艷，女，教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：ly136988＠163.com