二乙基亞硝胺誘導的肝癌小鼠TGF-βⅢ型受體的表達

張 森，孫嫵弋，谷元婧，魏偉

二乙基亞硝胺誘導的肝癌小鼠TGF-βⅢ型受體的表達

張 森，孫嫵弋，谷元婧，魏偉

目的觀察轉化生長因子（TGF-β）Ⅲ型受體（TβRⅢ）在二乙基亞硝胺（DEN）誘導的肝細胞癌（HCC）模型小鼠中的表達及其信號通路的變化。方法C57BL／6J小鼠腹腔注射DEN建立HCC小鼠模型；HE染色法觀察小鼠肝臟病理變化；ELISA法檢測小鼠肝臟組織中TGF-β1的水平；Western blot法檢測肝臟組織TβRⅢ、p-Smad2及Smad2蛋白的表達變化。結果HE染色結果顯示，對照組小鼠肝細胞大小形態正常，肝小葉結構完整，隨著造模時間的延長，模型組小鼠肝小葉逐漸被破壞，肝細胞異常增生，出現病理核分裂，HCC結節形成。在DEN誘導的HCC模型小鼠中，隨著造模時間的延長，肝臟TGF-β1的水平明顯升高，TβRⅢ蛋白的表達降低，p-Smad2蛋白的表達升高，而Smad2蛋白的表達沒有明顯變化。結論TβRⅢ表達的降低可能與HCC的發生發展有關。

TβRⅢ；TGF-β1；肝細胞癌；二乙基亞硝胺

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上常見的惡性程度高、預后較差且死亡率高的腫瘤之一［1］。外科HCC切除術、射頻消融治療和肝臟移植術雖然提高了患者的生存率，但是由于HCC的肝內播散和遠處轉移，導致其預后較其它惡性腫瘤差［2－3］。轉化生長因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）是由結構相近、功能類似的多肽組成的細胞因子，主要包括TGF-β、激活素、抑制素等。目前研究［4］表明，TGF-β／Smad信號通路不僅在胚胎發育、細胞增殖和分化等過程中發揮重要作用，也與腫瘤的發生發展有密切關系。TGF-βⅢ型受體（type ⅢTGF-β receptor，TβRⅢ）是TGF-β家族中的輔助性受體，調控TGF-β與受體的結合以及信號通路的激活。研究［5－8］顯示，在乳腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌等腫瘤的發展進程中，TβRⅢ表達降低甚至缺失。在HCC發展過程中，TβRⅢ表達是否發生變化，TGF-β信號通路又是否受到影響尚不清楚。該研究通過建立二乙基亞硝胺（diethylnitrosamine，DEN）誘導的HCC小鼠模型［9］，觀察TβRⅢ在HCC中的表達以及TGF-β信號的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 C57BL／6J小鼠，48只，雄性，2周齡，清潔級，購自安徽醫科大學實驗動物中心。在恒溫22℃、光照周期12 h環境中飼養，造模過程中死亡4只。

1.1.2 主要試劑 抗TβRⅢ抗體（英國Abcam公司）；抗Smad2、p-Smad2和β-actin抗體（美國Bioworld公司）；ELISA試劑盒（深圳達科為生物技術有限公司）；DEN（美國Sigma公司）；PVDF微孔轉移膜（美國Millipore公司）；5×電泳加樣緩沖液、RIPA蛋白裂解液、苯甲基磺酰氯（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）（江蘇碧云天公司）。

1.1.3 主要儀器與設備 LAS400Mini型化學發光成像分析儀（美國GE公司）；IX-70熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；ELx50型洗板機、ELx808型酶標儀（美國BioTek公司）；3-30K低溫高速離心機（美國Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 DEN誘導的C57BL／6J小鼠HCC模型的制備、分組及處理 出生后14 d的C57BL／6J小鼠，隨機分為對照組和模型組，每組8只，腹腔注射DEN 20 μg／g體重，以誘導小鼠肝臟腫瘤的發生。分別于注射DEN后8、16、24、32、40周處死小鼠，摘取部分肝臟組織放入EP管中，－80℃保存待測，另取一小塊肝臟組織經10%甲醛溶液固定，做病理檢測。

1.2.2 肝臟組織病理學檢查 取出肝臟，用冷生理鹽水洗去浮血，取肝組織小塊，厚度不超過0.5 cm，立即用10%甲醛溶液固定24 h。70%、80%、90%、100%乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，Lecia石蠟切片機切片，常規脫蠟，HE染色，中性樹脂封片后，OLYMPUS顯微鏡下觀察。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠肝臟組織中TGF-β1的表達 每50 mg肝臟組織加入500 μl生理鹽水，勻漿器中充分研磨，離心提取上清液。加樣前將待測樣品活化，待測樣品孔及各濃度標準品孔中，每孔加入100 μl，空白對照孔中加入100 μl稀釋緩沖液（1×），37℃孵育1.5 h，充分洗滌，加入100 μl生物素標記一抗，37℃孵育1.5 h，充分洗滌，加入親和素一辣根過氧化物酶標記二抗100 μl，37℃孵育30 min，充分洗滌后，加入四甲基聯苯胺顯色液100 μl，37℃避光孵育15 min后，每孔加入終止液100 μl，終止反應，使用酶標儀檢測各孔450 nm處吸光度。

1.2.4 肝組織蛋白的提取 裂解液配制：RIPA和蛋白酶抑制劑PMSF的比例為100∶1。肝組織放入勻漿器中按500 μl／50 mg組織加入裂解液研磨，轉入離心管中4℃離心，14 000 r／min離心20 min后吸取上清液，得到總蛋白。

1.2.5 Western blot法檢測肝臟組織中TβRⅢ、p-Smad2以及Smad2的表達 肝臟組織裂解液處理后提取總蛋白，經BCA蛋白定量試劑盒定量后，每泳道上等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，在轉移液中，以200 mA電流轉移至PVDF膜上。封閉2 h后，加入抗TβRⅢ、p-Smad2及Smad2抗體，4℃孵育過夜。洗滌后，繼以辣根過氧化物酶結合的二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯色。用ImageJ圖像處理軟件分析計算蛋白印跡值，將β-actin作為內參，用目的條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，數據以±s表示。采用單因素方差分析比較各組間差異。

2 結果

2.1 DEN誘導的HCC小鼠肝臟病理變化HE染色顯示，對照組小鼠肝臟組織無明顯變化，肝細胞大小形態正常，肝小葉結構完整；隨著造模時間的延長，肝小葉結構逐漸被破壞，肝細胞異常增生，細胞形態、大小不一，并且細胞的分化程度不均一，出現病理核分裂，HCC結節形成，40周后出現壞死。以上結果提示本實驗中小鼠HCC模型造模成功。見圖1。

2.2 DEN誘導的HCC小鼠肝臟組織中TGF-β1水平的變化ELISA結果顯示，與對照組比較，隨著造模時間的延長，模型組小鼠肝臟組織中TGF-β1水平不斷升高，差異有統計學意義（F＝6.65，P＜0.01）。見圖2。

2.3 DEN誘導的HCC小鼠肝臟組織中TβRⅢ蛋白表達變化半定量分析以對照組為基數1，計算各組比值的相對比例。Westernblot法檢測造模不同時間點小鼠肝臟中TβRⅢ蛋白的表達情況，結果顯示，DEN注射8周后，肝臟TβRⅢ的表達明顯低于對照組，隨著造模時間的延長，TβRⅢ表達明顯降低，40周時TβRⅢ表達最低，差異有統計學意義（F ＝148.87，P＜0.01）。見圖3。

2.4 DEN誘導的HCC小鼠肝臟組織中p-Smad2、Smad2蛋白表達變化半定量分析以對照組為基數1，計算各組比值的相對比例。Western blot法檢測造模不同時間點小鼠肝臟中p-Smad2、Smad2蛋白的表達情況，結果顯示，隨著造模時間的延長，p-Smad2蛋白的表達升高，而Smad2蛋白的表達無明顯變化，差異有統計學意義（F＝118.09，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

HCC是一類發病機制較為復雜的常見腫瘤，目前HCC已成為全世界第5大惡性腫瘤，致死率高居第3位［1-2］。近年來，HCC發病率持續上升，可能與感染肝炎病毒而導致肝硬化，以及慢性酒精性肝病增多有關。肝臟中相關分子的異常表達以及信號通路的過度激活在HCC發生發展中可能扮演著重要角色。本研究進一步探討HCC進程中的分子機制，明確相關分子的作用，對HCC的診斷和預后判斷提供幫助。

TGF-β能誘導上皮細胞和內皮細胞發生上皮間質轉化，促進細胞的遷移和侵襲能力，從而促進腫瘤的發展［10］。對非小細胞肺癌患者的研究［11］顯示，HCC組織中TGF-β1的表達明顯升高，且與患者的不良預后有關。此外，TGF-β1在卵巢上皮癌患者細胞外基質中的表達升高，與腫瘤的侵襲轉移密切相關［12］。本研究顯示，在DEN誘導的小鼠HCC模型中，與對照組比較，模型組肝臟組織中TGF-β1的表達水平明顯升高。提示HCC的不斷惡化可能與TGF-β1的高水平表達有關。

TβRⅢ是TGF-β家族的輔助性受體。研究［13］表明，在乳腺癌MDA-MB-231細胞和卵巢癌Ovca420細胞中，TGF-β1能夠降低TβRⅢmRNA和蛋白的表達，而對TβRI和TβRⅡ的表達沒有明顯影響。研究［6］顯示，TβRⅢ在乳腺癌中表達缺失，恢復TβRⅢ的表達能夠抑制乳腺癌細胞的遷移、侵襲以及血管生成。在胰腺癌和卵巢癌中，TβRⅢ的表達也出現降低甚至缺失的現象［14－15］。但TβRⅢ在HCC中表達情況尚不清楚。本研究結果顯示，隨著造模時間的延長，模型組中TβRⅢ的表達逐漸降低。以上結果提示，低表達的TβRⅢ與肝臟病理惡性程度有關，而自分泌型TGF-β1的高表達可能是TβRⅢ表達降低的原因。

Smad蛋白作為細胞內的TGF-β受體激酶的底物，在胞外信號經由膜受體轉導進入細胞核內的過程中發揮重要作用。其中，Smad2是TGF-β受體激活后傳遞信號的下游分子。在對乳腺癌的體內外研究［6］中均顯示，TβRⅢ的表達能夠抑制Smad2的磷酸化水平。本研究結果顯示，在HCC的發展過程中，p-Smad2蛋白表達逐漸升高，而Smad2蛋白表達無明顯變化，提示TGF-β信號通路過度激活，可能與肝臟組織中TGF-β1的表達升高有關，也可能是由于高表達的TGF-β1抑制了TβRⅢ的表達，導致Smad2的磷酸化水平升高。

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The expression of typeⅢTGF-β receptor in diethylnitrosamine-induced liver cancer model

Zhang Sen，Sun Wuyi，Gu Yuanjing，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University；Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine，Ministry of Education，Hefei 230032）

ObjectiveTo detect the expression of typeⅢTGF-β receptor（TβRⅢ）in diethylnitrosamine（DEN）-induced liver cancer model.MethodsC57BL／6J mice were intraperitoneally injected with DEN in a 20 μg／g dosage to establish liver cancer model.The pathological change of mice liver was observed by HE staining.The TGF-β1 level in liver tissue was measured by ELISA assay.The expressions of TβRⅢ，p-Smad2 and Smad2 were detected by Western blot.ResultsThe mice liver cell of the control group formed normal size with the complete hepatic lobule structure.With the time passing，hepatic lobule in model group mice was destroyed gradually with liver cell dysplasia，pathology of fission，tumor nodule formation.In DEN-induced liver cancer model，the TGF-β1 level was elevated compared with the control group and the TβRⅢprotein expression was significantly decreased.The expression of p-Smad2 protein was elevated，while Smad2 protein expression showed no obvious change.ConclusionThe low expression of TβRⅢmay play an essential role in the progression of hepatocellular carcinoma.

TβRⅢ；TGF-β1；hepatocellular carcinoma；DEN

R 735.7

A

1000－1492（2015）07－0912－05

2015－03－17接收

國家自然科學基金（編號：81300332，81330081）；高等學校博士學科點專項科研基金（編號：20113420120002）；安徽高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2012A153）

安徽醫科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，合肥 230032

張 森，男，碩士研究生；孫嫵弋，女，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：sunwuyi51＠hotmail.com；魏 偉，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn