β-catenin、DKK-1蛋白在出生前后雙酚A暴露的子鼠雄性生殖細胞中的表達

楊小四，劉曉利，宋先兵，張俊強，趙 歡，陳曉宇

β-catenin、DKK-1蛋白在出生前后雙酚A暴露的子鼠雄性生殖細胞中的表達

楊小四1，2，劉曉利1，宋先兵1，張俊強1，趙 歡1，陳曉宇1

目的探討Wnt／β-catenin信號通路主要蛋白（βcatenin、DKK-1）在出生前后雙酚A（BPA）暴露的成年子鼠雄性生殖細胞中的表達及意義。方法自受孕第0天（PGD0），ICR孕鼠飲水BPA染毒，隨機將孕鼠分為溶劑對照組、BPA低劑量（10 nmol／L）組、BPA中劑量（50 nmol／L）組、BPA高劑量（300 nmol／L）組，每組6只。雄性仔鼠出生后繼續飲水染毒，劑量同上，6周（PGD42）處死，取睪丸組織，計算睪丸系數；免疫組化和Western blot法檢測β-catenin、DKK-1蛋白的表達。結果BPA暴露組較溶劑對照組仔鼠睪丸臟器系數降低，β-catenin、DKK-1蛋白表達明顯增加；免疫組化顯示，β-catenin、DKK-1蛋白多位于睪丸間質細胞和精原細胞中。結論β-catenin、DKK-1可能參與了出生前后BPA暴露對子鼠雄性生殖細胞發育的影響。

雙酚A；β-catenin蛋白；DKK-1蛋白；睪丸生殖細胞

雙酚A（bisphenol A，BPA）是現代生活中人們不可避免接觸到的一類酚類環境雌激素，廣泛存在于塑料制品中，通過食品包裝材料、醫療器械和染料等塑料工業，經高溫水解或酸、堿作用釋放進入機體，干擾機體自身激素的合成和分泌等，對機體具有潛在、長期、破壞性的影響［1］。研究［2－3］證實孕期暴露BPA會影響子代雄鼠的生殖系統，但BPA影響機體的作用機制多樣。Wnt／β-連環蛋白（β-catenin）信號通路是一個關鍵信號通路，調節機體生長和發育［4］。目前Wnt／β-catenin信號通路在生殖細胞方面的研究較少。該研究通過小鼠出生前后暴露BPA，研究BPA對雄性小鼠睪丸組織的影響機制是否與Wnt／β-catenin信號通路有關，探討出生前后接觸BPA的子鼠雄性生殖細胞形成過程中與Wnt／βcatenin信號通路的關系及其下游調控主要蛋白βcatenin、DKK-1表達，旨在為闡明Wnt／β-catenin信號通路在BPA暴露的致畸作用提供一定的分子機制，為制定相應的防治措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器BPA（美國Sigma公司）；兔抗鼠多克隆抗體β-catenin、DKK-1、GAPDH（美國Santa Cruz公司）；羊抗兔免疫組化二抗試劑盒（福州邁新生物技術有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（海門碧云天公司）；PVDF膜（美國Bio-Rad公司）；Super Singal化學發光試劑盒（美國Pierce公司）；實驗所需其他試劑均為分析純；TSJ-1A型自動組織脫水機（天津天利航空機電有限公司）；RM2135型石蠟切片機（德國Leica公司）；BM-Ⅱ病理組織包埋機（安徽電力科學研究所）；80i生物顯微攝像和分析系統（日本Nikon公司）；BS210S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；SZ-97自動三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；BPA采用少量DMSO溶解配成1 mg／ml的母液，置于4℃冰箱保存，臨用時以純水稀釋至所需濃度（DMSO終濃度小于0.01%）。

1.2 實驗動物60只ICR雌鼠，30只ICR雄鼠，8 ～10周齡，體重（30.5±2.2）g，購自安徽省實驗動物中心，飼養于安徽醫科大學毒理教研室動物房。ICR鼠自由進食，飼養室溫（22±2）℃，光照維持12 h光照／12 h黑暗的晝夜節律，光照從早上7點開始，ICR鼠適應性飼養1周后進行實驗。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與給藥 90只成年ICR小鼠于晚上9時以雌鼠∶雄鼠為2∶1進行合籠，于次日上午9時檢查ICR雌鼠是否妊娠，妊娠標準為檢到陰栓。即確定為妊娠第0天（PGD0）。然后隨機分為溶劑對照組、BPA低劑量組（10 nmol／L）、BPA中劑量組（50 nmol／L）、BPA高劑量組（300 nmol／L），每組6只。為保持自然狀態，BPA采取自由飲水方式攝入，為保證BPA飲入濃度穩定，ICR孕鼠每2 d稱重1次；孕鼠自PGD0起開始染毒，哺乳期間繼續染毒，斷乳后雄性仔鼠繼續染毒至產后42 d（PGD42），脫頸椎處死，無菌操作下取雄性ICR仔鼠睪丸組織，稱量睪丸濕重，計算睪丸臟器系數。睪丸臟器系數＝睪丸濕重／體質量。將左側睪丸組織用于形態學檢查，右側睪丸組織置液氮凍存備測蛋白等。

1.3.2 免疫組化染色檢測雄性ICR仔鼠睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達 將新鮮左側睪丸組織置于10%多聚甲醛中固定，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，取出蠟塊后置于－20℃冰箱，冷凍適度后，用石蠟切片機切成4 μm厚的切片，90℃燒烤30 min，即可進行常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水，0.01 mol／L枸櫞酸鈉緩沖液微波抗原修復，3%H2O2于37℃溫箱孵育20 min，50 μl／片山羊血清封閉，37℃恒溫孵育30 min，吸去封閉血清、不需PBS沖洗；滴加50 μl／片兔抗鼠多克隆一抗β-catenin（1∶300）、DKK-1（1∶200），4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μl／片生物素化山羊抗兔IgG工作液，37℃恒溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；滴加50 μl／片羊抗兔辣根酶標記鏈霉卵蛋白二抗工作液，37℃恒溫孵育30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；DAB顯色，細胞核采用蘇木精復染；進行常規梯度乙醇上行脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。采用Nikon 80i生物顯微攝像與分析系統，觀察并記錄40倍物鏡下每個視野中β-catenin、DKK-1陽性蛋白表達數目。

1.3.3 Western blot法檢測β-catenin、DKK-1蛋白表達 取右側睪丸組織，取樣、稱重、勻漿，按照試劑盒說明書配置細胞裂解液裂解勻漿，3 000 r／min離心10 min，提取蛋白，BCA法蛋白定量。取50 μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，室溫下封閉1 h；加入兔抗鼠單克隆一抗β-catenin（1∶2 000）、DKK-1（1∶1 500）、GAPDH（1∶3 000），4℃冰箱孵育過夜；次日TBST脫洗3次，每次5 min；然后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體（1∶3 000）37℃孵育1 h，再TBST脫洗3次，每次5 min；ECL檢測液發光顯影定影、X線片曝光、洗片，Image J軟件進行灰度半定量分析。

1.4 統計學處理應用SPSS 15.0軟件進行分析，數據以±s表示。組間比較用單因素方差分析。

2 結果

2.1 BPA暴露對雄性子鼠睪丸臟器系數的影響母鼠自懷孕PGD0開始BPA染毒，實驗各組每只母鼠所產的子鼠的雌雄比例無顯著差異。與溶劑對照組比較，BPA暴露組的小鼠6周的睪丸重量下降，且隨著BPA暴露劑量的增加，子代雄鼠的睪丸臟器系數下降愈加明顯，睪丸臟器系數差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 免疫組化法檢測睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達情況溶劑對照組中β-catenin、DKK-1蛋白表達很弱或幾乎不表達；BPA暴露組中β-catenin、DKK-1蛋白表達明顯增強，有劑量依賴趨勢，且陽性表達細胞多位于近生精小管基膜的精原細胞和睪丸間質細胞中。見圖2。通過Nikon 80i生物顯微攝像和分析系統觀察并計數（×400）每個視野βcatenin、DKK1蛋白表達數目。隨著BPA暴露劑量的增加，β-catenin、DKK-1陽性細胞數逐漸增多，βcatenin、DKK-1蛋白陽性細胞計數與溶劑對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

2.3 Western blot法檢測睪丸組織β-catenin、DKK-1蛋白表達情況溶劑對照組中β-catenin、DKK-1蛋白較弱，隨著BPA暴露劑量的增加，βcatenin、DKK-1蛋白表達呈上升趨勢；BPA暴露組β-catenin／GAPDH、DKK-1／GAPDH與溶劑對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4。

3 討論

研究［5］顯示低劑量的BPA即對機體，包括胚胎發育、生殖、神經與免疫系統等產生一定的影響。研究［2，6］表明，BPA能引起受試小鼠精子畸形率大幅增加，精子生成量明顯減少、發育過程嚴重障礙，且存在明顯的劑量依賴性。與對照組比較，睪丸系數差異有統計學意義（P＜0.05），臟器系數用來反映臟器的腫大或是縮小、增生或是萎縮等變化，即臟器質量與體重的比值，在體重變化不是很顯著時，是對毒物導致臟器損傷的一個比較靈敏的指標。本研究顯示，出生前后BPA染毒導致了小鼠的睪丸臟器系數下降，提示BPA對子代雄性小鼠生殖細胞有一定的毒性作用，不同染毒劑量BPA暴露組對子鼠睪丸臟器系數均有影響且影響不同，隨著BPA染毒劑量的增加，睪丸臟器系數呈下降趨勢。亦提示了BPA對小鼠的睪丸臟器的毒性有劑量依賴性。

BPA的作用機制多樣，Wnt／β-catenin信號通路是機體生長和發育調節的一個重要的信號通路，其組成主要包括Wnt蛋白、β-catenin、Tcf／Lef核內轉錄因子家族及其下游靶基因［7］。β-catenin是最早發現的黏附因子，是一種多功能的蛋白質，主要位于細胞膜，其功能主要為介導細胞間黏附和參與基因的表達，廣泛存在于各型細胞中，參與細胞增殖、分化和凋亡［8］。在胚胎發育過程中，Wnt／β-catenin信號通路的下游靶基因多數為調控細胞周期的重要基因，在促進胚胎背腹軸的形成、加強細胞極性建立、引導細胞命運決定等多個環節中起重要作用［9］。誘導Wnt／β-catenin信號通路下游通路中的抑制劑骨形態蛋白（Bmps）和DKK-1蛋白表達，可誘導胚胎細胞凋亡，導致出生缺陷［10］，故DKK-1是Wnt／βcatenin信號通路下游通路中重要蛋白。

BPA通過干擾血睪屏障，導致生精細胞粘附力降低，進而導致生精細胞的功能障礙［1］。本研究顯示，β-catenin及DKK-1蛋白陽性細胞主要位于精原細胞、睪丸間質細胞及生精基膜附近的支持細胞等，影響雄性子鼠的血睪屏障，影響生精細胞粘附和生精細胞功能。β-catenin及DKK-1蛋白陽性細胞計數結果顯示，在溶劑對照組中β-catenin蛋白表達較弱，BPA暴露組中β-catenin及DKK-1蛋白表達明顯增強，主要位于精原細胞和睪丸間質細胞中，且隨著BPA劑量的增加，陽性細胞數逐漸增多。表明Wnt／β-catenin信號通路參與了BPA染毒對子鼠雄性生殖細胞的生長和發育，其具體機制有待進一步闡明。

（致謝：感謝安徽醫科大學毒理教研室沈彤博士在實驗造模中給予的幫助）

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Proteins expression of β-catenin，DKK-1 in bisphenol A exposure before and after birth on male rat reproductive cells

Yang Xiaosi1，2，Liu Xiaoli1，Song Xianbing1，et al
（1Dept of Histology and Embryology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Human Anatomy，Anqing Medical College，Anqing 246052）

ObjectiveTo explore the proteins expression and significance of β-catenin，DKK-1 in bisphenol A （BPA）exposure before and after birth on male rat reproductive cells.MethodsICR infected pregnant rats drinking water from the conception 0 day（PGD0）were randomly divided into：BPA solvent control group，10 nmol／L，50 nmol／L，300 nmol／L BPA groups.Male young rats were killed in the 6th week（PGD42）after birth，β-catenin and DKK-1 protein expressions in testicular tissue were detected by immune-histochemical stained and Western blot.ResultsCompared with the solvent control group，testicular viscera coefficient in BPA exposure group young mice decreased.Compared with the solvent control group，β-catenin and DKK-1 protein expression in BPA exposure group significantly increased with immunohistochemical results and Western blot.ConclusionThe main proteins of β-catenin，DKK-1 in Wnt／β-catenin signaling pathway proteins may be involved in the BPA exposure before and after birth on male rat reproductive cells.

bisphenol A；β-catenin protein；DKK-1 protein；testicular germ cell

A

1000－1492（2015）07－0929－04

2015－03－22接收

安徽省自然科學基金項目（編號：1208085MC53）；國家自然科學基金面上項目（編號：81373421）

1安徽醫科大學組胚教研室，合肥 230032

2安慶醫藥高等專科學校解剖教研室，安慶 246052

楊小四，男，碩士研究生，講師；陳曉宇，男，博士，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：chenxy＠ahmed.edu.cn

R 329.24