rhEPO對新型BPD模型肺組織BCL-2和Caspase-9表達的影響及意義

岳嗣鳳，張華

rhEPO對新型BPD模型肺組織BCL-2和Caspase-9表達的影響及意義

岳嗣鳳，張華

目的探討磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B（PI3K／AKT）通路在重組人促紅細胞生成素（rhEPO）保護新型支氣管肺發育不良（BPD）中的作用。方法40只定期受孕的SD大鼠，于孕第15天孕囊內注射脂多糖（LPS）或磷酸鹽緩沖液（PBS），新生大鼠分為4組：對照組、高氧組、rhEPO組、rhEPO＋LY294002組。采用Western blot法和RT-PCR法檢測肺組織中BCL-2和Caspase-9蛋白及mRNA表達。結果

支氣管肺發育不良；重組人促紅細胞生成素；細胞凋亡；磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B

支氣管肺發育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是早產兒重要的并發癥，致死率和致殘率極高。近年來，隨著肺泡表面活性物質和機械通氣的應用，極低出生體重兒和極早早產兒（胎齡＜28周）成活率不斷上升，BPD的發病率也呈逐年上升趨勢，目前仍無確切有效的防治方法。研究［1］顯示，重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）能治療并降低早產兒BPD的發病風險，于生后4周內使用療效明顯，但其機制尚未明確。磷脂酰肌醇3－激酶（phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K）／蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號轉導通路，參與調節細胞遷移、增殖、凋亡、膜泡轉運的過程。研究［2－3］證實，PI3K／AKT通路可通過B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）、半胱天冬酶（Caspase-9）和核轉錄因子（nuclear factor，NF-κB）等途徑發揮抑制細胞凋亡的作用。該研究應用rhEPO及LY294002干預新型BPD大鼠模型，觀察肺組織Caspase-9和BCL-2的表達，探討外源性rhEPO對新型BPD大鼠模型的保護機制，為rhEPO的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料清潔級SD大鼠，雌鼠40只，體重230～250 g；雄鼠20只，體重280～300 g，均由廣西醫科大學－廣西實驗動物中心提供。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）購自美國Sigma公司；LY294002購自美國Selleck公司；rhEPO購自協和發酵麒麟（中國）制藥有限公司；WIP裂解液購自北京博奧森生物技術有限公司；ECL化學發光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；BCL-2、Caspase-9及β-actin一抗購自武漢博士德生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒均購自北京康為世紀公司；β-actin、BCL-2引物由Invitrogen（上海）公司合成；Caspase-9引物由北京奧科鼎盛生物公司合成。引物序列：BCL-2（188 bp）上游引物：5′-GCCTTCTTTGAGTTCGGT-3′，下游引物：5′-TCAAACAGAGGTCGCAT-3′；Caspase-9（204 bp）上游引物：5′-TGGCATACACCCTGGACTC-3′，下游引物：5′-TCTCCATCAAAGCCGTGAC-3′；β-actin（299 bp）上游引物：5′-CCTTCTTGCAGCTCCTCCGTC-3′，下游引物：5′-TCTCCATATCGTCCCAGTTGGTG-3′。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型的制備及分組 40只懷孕第15天（70%胎齡）的SD大鼠隨機分成兩組：LPS組（30只）和PBS組（10只）。參閱前期本課題組的實驗方法［4］。孕鼠腹腔注射10%水合氯醛（5 ml／kg）麻醉，切開腹腔，將LPS（30 ng／ml）按5 μl每孕囊注射到孕囊內，PBS組注入等量的PBS。所產新生大鼠生后12 h內分為4組：對照組、高氧組、rhEPO組、rhEPO＋LY294002組，每組24只。高氧組新生大鼠連同母鼠一起飼養于氧箱內，持續給氧，維持氧濃度60%，氧箱內放置無水氯化鈣吸收水分，鈉石灰吸收過多的CO2；rhEPO治療組在高氧干預第1、3、5、7、9、11、13天背部皮下注射rhEPO（1 200 IU／kg），LY294002處理組于每次注射rhEPO前30 min背部皮下注射LY294002（0.3 mg／kg），共7次。對照組新生大鼠連同母鼠置常壓空氣中飼養。

1.2.2 肺組織標本采集 于實驗第1、7、14天每組隨機選取8只，10%水合氯醛（3 ml／kg）腹腔麻醉后，斷頭放血處死動物，迅速打開胸腔，取雙肺，液氮速凍后存于－80℃冰箱保存備用。

1.2.3 Western blot法檢測肺組織BCL-2、Caspase-9蛋白表達 在液氮冷凍下研磨肺組織，將組織粉末轉移到EP管中，加入1 ml WIP裂解液，冰上放置15 min，4℃、12 000 r／min離心15 min，取上清液并適量分裝，測定總蛋白濃度，調整蛋白濃度，按各孔加入30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干法轉膜，含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，然后加入BCL-2、Caspase-9或β-actin一抗（1∶300稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后加入辣根酶標記的二抗（1∶6 000稀釋），室溫孵育50 min，洗膜后進行ECL顯影，X光片曝光，拍照測定條帶灰度值，計算BCL-2和Caspase-9與β-actin灰度值的比值，重復3次，取平均值。

1.2.4 肺組織BCL-2、Caspase-9 mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法，將肺組織研磨成粉末，根據超純總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，取2 μl RNA溶液置于1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測其完整性，紫外分光光度計測RNA濃度和純度，計算上樣體積，取總RNA 3 μg逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，以β-actin為內參。取5 μl擴增產物于含有EB的1.8%瓊脂糖凝膠上電泳，結果通過自動凝膠圖像分析儀顯示并拍照，分別測定條帶光密度值，計算BCL-2、Caspase-9與β-actin光密度值的比值，重復3次，取平均值。

1.3 統計學處理采用SPSS 18.0軟件進行分析，數據以±s表示。各組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結果

2.1 肺組織BCL-2和Caspase-9蛋白的表達實驗第1、7、14天：與對照組比較，高氧組BCL-2蛋白表達顯著減弱，Caspase-9蛋白表達顯著增強，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與高氧組比較，rhEPO 組BCL-2蛋白表達增加，Caspase-9蛋白表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與rhEPO組比較，rhEPO＋LY294002組BCL-2蛋白表達明顯下降，Caspase-9蛋白表達明顯升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；高氧組和rhEPO＋LY294002組BCL-2蛋白表達均明顯降低，Caspase-9蛋白表達均明顯增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

表1 不同實驗組各時間點大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9蛋白的表達（n＝8，±s）

表1 不同實驗組各時間點大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9蛋白的表達（n＝8，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與高氧組比較：＃P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05

項目對照組高氧組rhEPO組rhEPO＋LY294002組F值P值BCL-2 第1天0.56±0.140.35±0.10*0.46±0.09＃0.35±0.07△7.4520.002 第7天0.59±0.150.37±0.11*0.56±0.13＃0.37±0.10△7.1450.001 第14天0.75±0.220.41±0.16*0.64±0.20＃0.41±0.15△6.6100.002 Caspase-9 第1天0.33±0.070.52±0.11*0.40±0.11＃0.50±0.09△6.5910.002 第7天0.37±0.080.63±0.11*0.39±0.09＃0.62±0.12△15.6990.000 第14天0.44±0.080.81±0.11*0.49±0.09＃0.79±0.14△26.4330.000

2.2 肺組織BCL-2和Caspase-9 mRNA的表達實驗第1、7、14天：與對照組比較，高氧組BCL-2 mRNA表達明顯減少，Caspase-9 mRNA表達明顯增強，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與高氧組比較，rhEPO組BCL-2 mRNA表達增加，Caspase-9 mRNA表達下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與rhEPO組比較，rhEPO＋LY294002組BCL-2 mRNA表達明顯降低，Caspase-9 mRNA表達顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；高氧組和rhEPO＋LY294002組，BCL-2 mRNA表達均明顯降低，Caspase-9 mRNA表達均顯著增加，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2，圖2、3。

3 討論

目前認為早產、宮內感染性肺炎、長時間吸氧及機械通氣等是BPD的主要危險因素［5］。研究［6］顯示，80%早于30周分娩的產婦存在不同程度的宮內感染，胎肺長期暴露于炎性環境中。早產兒，尤其是小早產兒肺功能不完善，需要長時間吸氧和機械通氣，常并發氣壓傷及反復肺部感染，加重肺血管及肺間質損傷。新生SD大鼠與新生兒肺發育過程具有很強的相似性，新生大鼠的肺發育處于囊泡期，肺泡期發生于生后4～13 d，新生大鼠相當于胎齡＜30周早產兒的肺發育階段［7］。本實驗模擬宮內感染及生后高氧暴露建立新型BPD模型，并在此基礎上做進一步實驗研究，具有科學性和可行性。

宮內炎性暴露及生后高氧損傷是導致新型BPD發生的重要因素。研究［8］表明，孕期注射LPS可導致胚胎期及出生早期肺組織細胞過度凋亡，肺組織上皮細胞和微血管內皮細胞受損，肺微血管發育受阻，其機制可能與Bax／Bcl-2途徑有關。動物實驗［9］顯示，高氧干預可導致新生小鼠肺組織細胞凋亡數目增加，隨著高氧時間延長肺凋亡數增加越明顯，凋亡數與肺損傷程度相關［9］。本實驗結果顯示，LPS（30 ng／ml）孕囊注射聯合生后高氧可增加肺Caspase-9表達、減少BCL-2表達，推測宮內感染聯合生后高氧暴露可導致新生大鼠肺細胞凋亡增加。

rhEPO是一種多功能的糖蛋白類激素，具有抗氧化、抗炎、抑制凋亡及促進血管生成等非造血作用［10］，對高氧和感染所致的肺損傷具有保護作用。研究［11］顯示，rhEPO可減少高氧肺損傷模型的細胞凋亡指數，從而減輕高氧性肺損傷。本實驗結果顯示，rhEPO干預能有效減少SD新生大鼠新型BPD模型肺Caspase-9蛋白及mRNA表達，同時增加BCL-2蛋白及mRNA表達，從而推測rhEPO可能通過抑制細胞凋亡，對新型BPD發揮保護作用。

表2 不同實驗組各時間點大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9 mRNA的表達（n＝8，±s）

表2 不同實驗組各時間點大鼠肺組織BCL-2和Caspase-9 mRNA的表達（n＝8，±s）

與對照組比較：*P＜0.05；與高氧組比較：＃P＜0.05；與rhEPO組比較：△P＜0.05

項目對照組高氧組rhEPO組rhEPO＋LY294002組F值P值BCL-2 第1天0.32±0.040.09±0.04*0.18±0.03＃0.12±0.02△63.9610.000 第7天0.45±0.090.17±0.12*0.36±0.10＃0.20±0.08△14.8760.000 第14天0.51±0.090.10±0.08*0.44±0.12＃0.14±0.03△49.1810.000 Caspase-9 第1天0.21±0.140.59±0.09*0.41±0.14＃0.62±0.07△21.5820.000 第7天0.27±0.120.74±0.09*0.37±0.13＃0.76±0.05△50.4220.000 第14天0.25±0.150.91±0.07*0.30±0.10＃0.86±0.11△81.3220.000

PI3K是聯系胞外信號與細胞內應答效應的橋梁，可通過多種途徑作用于其下游信號因子，對細胞凋亡起調節作用［12－13］，其中Caspase-9是PI3K／AKT傳導通路下游細胞凋亡的啟動者和效應者，BCL-2則具有抗凋亡的作用。LY294002是PI3K特異性抑制劑，通過抑制PI3K活性，使AKT活化受阻，抑制PI3K／AKT通路的功能。本課題前期研究［3］顯示：在新型BPD模型中，rhEPO明顯增加肺組織PI3K蛋白和mRNA的表達，有效減少肺細胞的凋亡，推測rhEPO的抗凋亡作用可能與上調PI3K／AKT通路有關。本實驗通過在新型BPD模型新生大鼠背部皮下注射LY294002（0.3 mg／kg），然后觀察Caspase-9和BCL-2表達變化，結果顯示Caspase-9蛋白及mRNA表達顯著增強，而BCL-2蛋白及mRNA表達減弱，推測rhEPO對新型BPD的保護機制可能與PI3K／AKT信號轉導通路有關。

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The effect and significance of rhEPO to the expression of BCL-2 and Caspase-9 in the new type BPD model’s lung tissue

Yue Sifeng，Zhang Hua
（Dept of Newborn，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541001）

ObjectiveTo explore the role of phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase B（PI3K／AKT）pathway in recombinant human erythropoietin（rhEPO）protecting new type BPD.MethodsInjected LPS or PBS to 40 sprague-dawley（SD）rats，gestational sacs on 15th day of gestation，the newborn rats were divided into four groups：control group，hyperoxia group，rhEPO group，rhEPO＋LY294002 group.To detect the expression of lung tissue BCL-2 and Caspase-9 protein and mRNA by Western blot and RT-PCR.ResultsIn the hyperoxia group and rhEPO＋LY294002 group，BCL-2 expression was decreased，while Caspase-9 expression was increased apparently；in the rhEPO group，BCL-2 expression was increased，while Caspase-9 expression was decreased.The differences between each group were statistically significant on 1st，7th and 14th day of hyperoxia exposure（P＜0.05）.ConclusionIntrauterine inflammatory exposure combined with hyperoxia after birth can cause lung cell apoptosis increases.While rhEPO has certain control effects on BPD，possibly by reducing the pulmonary apoptosis.The mechanism may be associated with PI3K／AKT signaling pathway.

bronchopulmonary dysplasia；recombinant human erythropoietin；apoptosis；phosphatidylinositol 3-kinase／protein kinase B

R 332

A

1000－1492（2015）07－0933－04

2015－03－10接收

廣西醫療衛生重點科研課題（編號：重2011011）

桂林醫學院附屬醫院新生兒科，桂林 541001

岳嗣鳳，女，碩士研究生；張 華，男，副教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：zh4205＠163.com

高氧組、rhEPO＋LY294002組新生大鼠肺組織BCL-2蛋白及mRNA表達減少，Caspase-9蛋白及mRNA表達明顯增加；rhEPO組BCL-2蛋白及mRNA表達增加，Caspase-9蛋白及mRNA表達減少；于高氧暴露第1、7、14天各組間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論宮內炎性暴露聯合生后高氧可導致肺細胞凋亡增加，rhEPO可能通過減少肺細胞凋亡，對新型BPD起一定的保護作用，其機制可能與PI3K／AKT信號轉導通路有關。