PPAR δ激動劑GW501516對大鼠骨髓基質干細胞分化的作用

陶曉燕，潘天榮，鐘 興，杜益君，王秀艷

PPAR δ激動劑GW501516對大鼠骨髓基質干細胞分化的作用

陶曉燕，潘天榮，鐘 興，杜益君，王秀艷

目的探討過氧化物酶體增殖激活受體δ（PPAR δ）激動劑GW501516對大鼠骨髓基質干細胞（BMSCs）向成脂和成骨方向分化的作用。方法全骨髓培養法培養大鼠原代BMSCs后采用差速貼壁法純化，流式細胞儀鑒定其細胞表面標志物，實驗分為PPAR δ激動劑組和對照組，分別進行成骨和成脂方向誘導培養，熒光定量PCR檢測成骨細胞分化標志物（堿性磷酸酶、骨鈣素）和脂肪細胞分化標志物（脂肪酸結合蛋白2、脂連素）mRNA的表達，油紅O染色檢測脂肪細胞分化，茜素紅染色檢測成骨細胞礦化情況。結果與對照組比較，PPAR δ激動劑促進BMSCs向成骨細胞方向分化標志物表達，抑制向脂肪細胞方向分化標志物表達。茜素紅染色顯示PPAR δ激動劑組細胞礦化結節較對照組增加，油紅染色顯示PPAR δ激動劑組脂肪小滴明顯減少。結論PPAR δ激動劑促進BMSCs向成骨方向分化，抑制其向成脂方向分化。

骨質疏松；PPAR δ；骨髓基質干細胞；細胞分化

骨質疏松癥可增加骨折風險，增加致殘率及死亡率，目前已成為一個嚴重的公共健康問題［1］。骨質疏松癥主要是骨吸收增加和骨形成降低導致的骨量下降。骨吸收和骨形成主要涉及成骨細胞和破骨細胞的作用，而骨髓間充質干細胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）向成骨細胞和脂肪細胞方向的分化失調會導致骨質疏松的發生［2］。研究［3］顯示過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）γ促進BMSCs向脂肪細胞系分化，抑制其向成骨細胞系的分化。PPAR δ與PPAR γ三維結構十分相似，廣泛表達于包括骨組織在內的多種組織中，在脂肪細胞分化和能量代謝中具有重要作用。PPAR δ激動劑GW0742和過表達PPAR δ能抑制3T3-L1前脂肪細胞向脂肪細胞的分化［4］，但對BMSCs的分化作用的研究尚未見報道。該研究探討PPAR δ激動劑GW501516對大鼠BMSCs向成脂和成骨方向分化的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器3周齡雄性SD大鼠（安徽醫科大學實驗動物中心）；低糖DMEM培養基、胰蛋白酶、FBS（美國Hyclone公司）；β-甘油磷酸鈉、地塞米松、左旋抗壞血酸、吲哚美辛、異丁基黃嘌呤、胰島素、青－鏈霉素、茜素紅、油紅O、倒置相差顯微鏡、CO2培養箱、高壓滅菌器、流式細胞儀、恒溫高速離心機、LightCycler?480 System Real Time PCR擴增儀、Real-time PCR兩步法試劑盒（日本TaKaRa公司）；CD29、CD90、CD11b、CD45抗體（英國Abcam公司）。

1.2 BMSCs的培養與鑒定

1.2.1 細胞培養 將大鼠麻醉后處死，75%酒精浸泡10 min，無菌條件下取兩后肢長骨，除去骨表面附著的軟組織，75%酒精中浸泡2 min，PBS清洗干凈，將兩端干骺端剪開，顯露骨髓腔，用含15%FBS的低糖DMEM培養液沖洗骨髓腔，以沖出骨髓，用吸管反復輕柔吹打沖出的液體，用篩網過濾后將濾出的液體按106～107個／ml密度接種于培養瓶中。24 h后輕柔搖晃培養瓶，倒出培養液，用PBS輕柔沖洗2遍，加入新的含15%FBS的培養液，2 d換1次液，至細胞長滿整瓶。

1.2.2 細胞純化 采用差速貼壁法純化細胞。倒出培養液，用PBS沖洗2遍，加入1 ml胰酶消化至細胞變圓，少許脫落，加入含15%FBS的培養基，輕輕吹打瓶壁，吸出被吹打脫落的細胞混懸液，加入新的培養瓶中，水平放入培養箱中孵育30 min后，再次拿出培養瓶，輕輕直立培養瓶，吸出培養液，再次加入新的培養瓶中，放入培養箱中培養，直至長滿瓶底80%左右，再次進行相同的步驟進行差速貼壁，反復共3次。采用流式細胞儀鑒定BMSCs，取第3 代BMSCs進行下一步實驗。

1.2.3 BMSCs鑒定 第3代BMSCs經PBS清洗3遍，胰酶消化后，再用1 ml PBS重懸后轉入1.5 ml EP管中，1 500 r／min離心5 min，棄上清液，再次1 ml PBS重懸，細胞濃度為1×106個／ml，分別加入CD29、CD90、CD11b、CD45抗體，避光、4℃、30 min孵育后，再用PBS清洗1遍，0.3 ml PBS再次重懸，上流式細胞儀檢測。

1.3 試劑配制成骨誘導液：10%胎牛血清＋90% DMEM培養基中加入10 mmol／L β-甘油磷酸鈉、1 ×10－8mol／L地塞米松、50 mg／L左旋抗壞血酸、1%青－鏈霉素。

成脂誘導液：10%胎牛血清＋90%DMEM培養基中加入1 μmol／L地塞米松、200 μmol／L吲哚美辛、0.5 mmol／L異丁基甲基黃嘌呤、10 μmol／L胰島素、1%青－鏈霉素。

GW501516的配制：使用DMSO溶解GW501516，配制濃度為0.1 mmol／L，避光常溫保存備用。

油紅O染液配制：稱取0.5 g油紅O粉末溶于100 ml異丙醇中，使用前過濾，并按3∶2比例使用蒸餾水稀釋。

茜素紅染液配制：稱取0.1 g茜素紅粉末加入100 ml異丙醇中，調節pH值至7.2，常溫避光保存。

1.4 試驗分組和誘導分化第3代BMSCs接種至培養皿中，長滿皿底80%以上時，隨機分為PPAR δ激動劑組（GW501516）10瓶和對照組10瓶，棄去原培養液，PPAR δ激動劑組5瓶加入2 ml的成骨誘導液，5瓶加入2 ml的成脂誘導液，每個再分別加入20 μl的GW501516配液，使得培養皿中GW501516最終濃度為10 nmol／L；對照組5瓶加入2 ml成骨誘導液，5瓶加入2 ml成脂誘導液，另外每個培養皿中加入20 μl的DMSO作為空白對照，2 d更換成骨／成脂誘導液1次，并在換液時添加GW501516及空白對照，誘導培養14 d后進行下一步實驗。

1.5 成骨及成脂細胞染色及觀察

1.5.1 油紅O觀察成脂分化 成脂誘導細胞棄去培養皿中原培養液，使用PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min后棄去，加入油紅O染液染色30 min后棄去，加入60%的異丙醇沖洗5 s，隨后立即棄去并用PBS緩慢沖洗3遍，顯微鏡下觀察脂滴染色情況。

1.5.2 茜素紅染色觀察成骨分化 成骨誘導細胞棄去培養皿中原培養液，使用PBS沖洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min后棄去，加入茜素紅染液37℃、30 min棄去，PBS沖洗3遍，顯微鏡下觀察成骨礦化情況。

1.6 Real-time PCR檢測成脂及成骨分化指標取上述誘導培養細胞棄去原培養液，使用TRIzol法提取總RNA后，熒光定量PCR法檢測成脂分化指標［脂肪酸結合蛋白2（adipocyte fatty acid binding protein 2，ap2）、脂連素］及成骨分化指標［堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素］的mRNA表達。

1.6.1 cDNA第一鏈的合成 各樣品總RNA分別各取4 μl，采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，42℃孵育30 min，加熱至95℃，維持30 min，得到cDNA溶液，置冰浴中待用。

1.6.2 PCR的步驟 PCR擴增ap2、脂連素、ALP及骨鈣素，同時擴增β-actin內參，引物序列見表1。反應體系：共20 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM使用量為10 μl，上下游引物各0.4 μl，cDNA 2 μl，無DNAse和RNAse的水7.2 μl。反應條件：95℃預變性30 s，活化Tag酶；94℃5 s，60℃20 s，40個循環結束。

表1 基因引物序列

1.6.3 PCR產物分析 內參基因和目的基因熔解曲線尖峰在同一軸上，未見雜峰，說明引物與模板特異性結合，所測CT值有意義。采用2－ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

1.7 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，所有符合正態分布的計量數據以±s表示。組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 SD大鼠BMSCs的分離、培養與鑒定

2.1.1 原代大鼠BMSCs分離與培養 接種24 h后棄去未貼壁細胞，可見少量貼壁細胞，細胞呈梭形或三角形，繼續培養至長滿培養瓶底80%，培養至第3代細胞第3天，細胞數目明顯增多，貼壁生長，大部分呈長梭形，少部分呈三角形或不規則形，成瀑布或漩渦狀排布。見圖1。

2.1.2 BMSCs表面抗原鑒定結果 采用流式細胞儀檢測第3代的BMSCs。結果顯示細胞表面抗原CD11b表達率約為7.51%，CD29表達率約為99.85%，CD45表達率約為7.14%，CD90表達率約為99.49%。細胞表面高表達CD29、CD90，低表達CD11b、CD45。見圖2。

2.2 茜素紅及油紅O染色結果成骨誘導液誘導培養14 d，茜素紅染色后顯微鏡下觀察細胞礦化結節，PPAR δ激動劑組（圖3B1）礦化結節數量較對照組（圖3A1）明顯增多；成脂誘導液誘導培養14 d，油紅O染色觀察細胞內脂滴，PPAR δ激動劑組（圖3B2）脂滴數量較對照組（圖3A2）明顯減少。

2.3 Real-time PCR結果分析與對照組比較，PPAR δ激動劑組ALP（2.596±0.588）和骨鈣素mRNA（2.891±0.368）的表達顯著升高（P＜0.01），ap2（0.567±0.038）和脂連素（0.616± 0.075）mRNA表達顯著下降（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

PPAR δ屬于核受體超家族，能介導親脂性小分子化合物，如類固醇、視黃酸X、膽汁酸等調節DNA轉錄。目前已合成了多種PPAR δ的人工配體，其中2003年葛蘭素史克發現的PPAR δ特異性選擇性激動劑GW501516引發了對該受體的關注，人們逐漸認識到PPAR δ在參與能量和脂質代謝上的作用。在小鼠的脂肪組織中轉基因表達PPAR δ可阻止小鼠因高脂飲食而導致的肥胖［5］；相反，PPAR δ缺陷的小鼠則顯示能量解偶聯的下降，易發生肥胖，血脂水平增高。以上研究提示PPAR δ可能在能量代謝及脂代謝中起著一定的作用，但目前其在骨代謝方面的研究較少。

BMSCs是近年來研究的熱點，在體內外不同條件下能夠誘導分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞以及骨骼肌細胞等，也可以分化成破骨支持細胞，對破骨細胞活動發出信號指示，從而調節骨代謝平衡［6－7］。脂肪細胞分化與骨代謝密切相關，主要因為成骨細胞和脂肪細胞共同來源于BMSCs［8］。動物研究［9］顯示，通過去勢手術人為造成絕經后骨質疏松模型的大鼠，其體內BMSCs向脂肪細胞分化的能力增強，而向成骨細胞分化的能力減弱，由此推斷，BMSCs向成骨及成脂方向分化趨勢的改變可能是造成骨質疏松的重要因素之一。因次，本研究選擇BMSCs作為研究對象。

本研究結果提示PPAR δ激動劑GW501516能夠顯著增加礦化結節數量，減少脂肪細胞分化及脂滴數。體外研究［4］顯示PPAR α／δ激動劑（苯扎貝特）刺激嚙齒類成骨細胞分化和礦化結節的形成，主要通過PPAR δ途徑發揮作用［10］。Scholtysek et al［11］也使用PPAR δ激動劑GW501516，發現PPARδ選擇性特異性激動劑能夠促進去卵巢小鼠骨量的增加，體外實驗提示能促進原代成骨細胞礦化結節的形成，本研究結果與之類似，進一步證實PPAR δ激動劑能促進骨的合成代謝。

BMSCs向成骨細胞或脂肪細胞分化是一個伴隨多種轉錄因子及特異性基因表達的過程。ALP的表達是檢測成骨細胞在早期分化活動標志之一，能夠反映細胞的成骨分化能力［12］；骨鈣素是骨基質礦化的必需物質，反映新形成的成骨細胞的活動狀態［13］。本研究結果顯示PPAR δ激動劑GW501516促進BMSCs成骨分化標志物ALP和骨鈣素的表達，與Zhong et al［14］研究結果類似。Zhong et al研究提示PPAR α／δ激動劑（苯扎貝特）主要通過PPAR δ途徑促進成骨細胞分化標志物的表達。脂肪細胞分化方面，脂聯素和ap2是脂肪細胞分化后期表達的特異性基因。本研究結果還顯示PPAR δ激動劑GW501516抑制成脂分化標志物ap2及脂連素表達。

綜上所述，本研究結果提示PPAR δ激動劑能夠促進BMSCs向成骨方向分化，抑制其向脂肪細胞方向分化，因此，PPAR δ在骨合成代謝中起著重要的作用，可為臨床骨質疏松癥的治療提供新的靶點。

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The effect of PPAR δ agonist-GW501516 on the differentiation of rats bone marrow stromal stem cells

Tao Xiaoyan，Pan Tianrong，Zhong Xing，et al
（Dept of Endocrinology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the effect of peroxisome proliferators-activated receptor δ（PPAR δ）agonist GW501516 on the adipogenic and osteogenic differentiation of rats bone marrow stromal stem cells（BMSCs）. Methods Rat BMSCs were cultured using whole marrow adhesion method.The biomarkers on the cell membrane were identified using flow cytometry.BMSCs were randomly divided into PPAR δ agonist group and control group. The expression of osteoblast differentiation markers（alkaline phosphatase，osteocalcin）and adipocyte differentiation markers（ap2，fat vitronectin）were detected using Real-time PCR after osteogenic and adipogenic induced culture.Mineralized nodules and lipid droplets were detected using alizarin red and oil red O staining.ResultsCompared with the control group，cells in PPAR δ agonist group had more expression of osteoblast differentiation markers and less expression of adipocyte differentiation markers.There were more mineralized nodules and fewer lipid droplets in the PPAR δ agonist group.ConclusionPPAR δ agonist can promote osteogenic differentiation of BMSCs，and inhibit their differentiation into adipocytes direction.

osteoporosis；PPAR δ；bone marrow stem cells；cell differentiation

R 589.5

A

1000－1492（2015）07－0942－05

2015－04－23接收

安徽省年度重點科研項目（編號：12070403068）；安徽省自然科學基金（編號：1308085MH123）

安徽醫科大學第二附屬醫院內分泌科，合肥 230601

陶曉燕，女，碩士研究生；潘天榮，男，副教授，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：ptr1968＠163.com