TLR4 mAb對人正常肝內膽管上皮細胞LPS-TLR4-NF-κB通路的影響

劉 輝，余宏鑄，韓 瓏，王正林

TLR4 mAb對人正常肝內膽管上皮細胞LPS-TLR4-NF-κB通路的影響

劉 輝，余宏鑄，韓 瓏，王正林

目的對脂多糖（LPS）及Toll樣受體4單克隆抗體（TLR4 mAb）作用于體外培養的人肝內膽管細胞（HiBEC）后其TLR4 mRNA和核轉錄因子-κB（NF-κB）mRNA的表達情況進行了研究。方法體外培養HiBEC，采用RT-PCR法檢測經LPS和不同濃度的TLR4 mAb作用后，HiBEC細胞株中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達情況。結果LPS可以上調HiBEC中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達（P＜0.05）；而LPS作用于TLR4 mAb處理后的HiBEC中其TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達下調；高質量濃度TLR4 mAb使NF-κB mRNA的表達下調更明顯（P＜0.05）。結論LPS能上調HiBEC中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達；而TLR4 mAb則能拮抗LPS對HiBEC的刺激作用，下調TLR4 mRNA和NF-κB mRNA的表達。

脂多糖；Toll樣受體4單克隆抗體；Toll樣受體4；核轉錄因子-κB

肝內膽管細胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是一類來源于肝內二級膽管以上的膽管上皮細胞惡性腫瘤［1］，在原發性肝癌中占第二位，約為5%～30%，僅次于肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。臺灣超過70%的ICC患者合并肝內膽管結石，日本6%～8%的ICC患者手術切除標本中發現了肝內膽管結石。研究［2］顯示，肝內膽管結石患者中有3%～10%的患者最終會發生ICC，肝內膽管結石是ICC的危險因素之一。關于脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）-Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）-核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）經典炎癥通路在人肝內膽管細胞（human intrahepatic biliary epithelial cell，HiBEC）中的作用研究［3－5］較少。該試驗通過體外細胞培養，研究LPS 及TLR4單克隆抗體（TLR4 monoclonal antibodies，TLR4 mAb）作用于體外培養的HiBEC后其的TLR4 和NF-κB的表達情況，以探討LPS是否通過TLR4影響HiBEC中TLR4和NF-κB的表達情況以及LPS-TLR4-NF-κB通路在HiBEC中的作用，為下一步尋找特異性的藥物阻止受膽管結石長期刺激的膽管壁細胞發生癌變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑HiBEC購自上海雷蒂生物科技發展有限公司；RPMI-1640培養基購自美國Invitrogen公司；四季青胎牛血清購自浙江天杭生物技術公司；LPS、DEPC購自美國Sigma公司；TLR4 mAb購自美國eBioscience公司；逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司；PCR反應液6×Loading buffer購自日本TaKa-Ra公司；氯仿、無水乙醇溶液、異丙醇溶液均購自上海蘇懿化學試劑有限公司；核酸染料goldview購自北京賽百盛公司；所有引物由primer 5.0軟件設計，由上海生工生物工程公司合成（表1）。所有儀器由安徽醫科大學中心實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 HiBEC培養 RPMI-1640培養基中添加15%胎牛血清、100 U／ml青霉素、100 U／ml鏈霉素為完全培養基，將HiBEC接種于培養瓶中，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養箱中培養。當細胞生長密度達80%，換成不含青霉素、鏈霉素，含15%胎牛血清的RPMI-1640培養基中繼續培養。

1.2.2 實驗分組 預實驗顯示HiBEC在4 μg／ml LPS、1 μg／ml TLR4 mAb、3 μg／ml TLR4 mAb作用24 h的條件下，活性沒有產生不可逆性改變，細胞數量沒有發生改變，顯微鏡下觀察細胞形態無明顯改變，細胞核未見萎縮。將HiBEC培養至第4代，然后分成以下6組：對照組（僅加培養液）；A組（加入終質量濃度為4 μg／ml的LPS）；B組（加入終質量濃度為1 μg／ml TLR4 mAb）；C組（加入終質量濃度為3 μg／ml的TLR4 mAb）；D組（終質量濃度為1 μg／ml的TLR4 mAb預處理24 h，再加入終質量濃度為4 μg／ml的LPS作用6 h）；E組（終質量濃度為3 μg／ml的TLR4 mAb預處理24 h，再加入終質量濃度為4 μg／ml的LPS作用6 h）。將以上6組細胞放入37℃、5%CO2的培養箱內培養。

1.2.3 RT-PCR檢測 收集細胞于1.5 ml離心管內，去除上層培養液。加入TRIzol試劑充分裂解，依次加入氯仿、異丙醇、75%乙醇溶液，4℃離心，棄上清液，室溫干燥30 min后用30～50 μl DEPC水溶解，在55℃下促進溶解10 min，置于－80℃保存備用。用逆轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄成單鏈cDNA，再行RT-PCR，用比較Ct法（ΔΔCt）分析結果。TLR4、NF-κB和GAPDH引物見表1。

表1 TLR4、NF-κB和GAPDH引物序列

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據以±s表示。組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 TLR4 mRNA的表達RT-PCR法檢測結果顯示，與對照組比較，A組LPS作用于HiBEC后，TLR4 mRNA表達明顯上調（P＜0.05）；而B、C、D、E組TLR4 mRNA表達與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與A組比較，B、C、D、E組TLR4 mRNA表達均明顯下調（P＜0.05）；B組和C組TLR4 mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）；D組和E組TLR4 mRNA表達差異無統計學意義（P ＞0.05）。見圖1A。組間差異有統計學意義（F＝69.989，P＜0.05）。

2.2 NF-κB mRNA的表達RT-PCR法檢測結果顯示，與對照組比較，A組LPS作用于HiBEC后，NF-κB mRNA表達明顯上調（P＜0.05）；與A組比較，B、C、D、E組NF-κB mRNA表達均明顯下調（P ＜0.05）；與D組比較，E組NF-κB mRNA表達下調（P＜0.05）。見圖1B。組間差異有統計學意義（F ＝31.737，P＜0.05）。NF-κB的擴增曲線見圖2。

3 討論

通常情況下，炎癥通過聚集炎癥細胞來保護感染或受損組織，同時將其隔離，以防止感染的擴散，并且一旦炎癥消退，正常組織功能通常可以恢復。然而，在某些情況下，炎癥無法消退，長期慢性炎癥刺激可促進腫瘤細胞的生長、存活和血管生成［6］。膽道感染主要以革蘭陰性細菌感染為主，而LPS是革蘭陰性細菌細胞壁中的主要成分，也是致病的主要成分。LPS、LPS結合蛋白、CD14形成三體復合物后可以結合TLR4／髓樣分化蛋白2復合體，將LPS的刺激信號向細胞內轉導激活下游信號傳導通路。Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）是一種可以介導機體損傷修復的細胞表面感受器，在癌細胞的免疫逃逸中起重要作用。TLR4是TLRs中的一種亞型，在腫瘤細胞和組織中的表達率是TLRs中最高的，推測其在腫瘤的發生和進展中起著重要的作用［7］。TLR4與LPS結合后可以激活NF-κB，激活的NF-κB與炎癥，細胞轉化，腫瘤細胞存活、增殖、侵襲、血管生成和轉移有關。NF-κB是致癌物質的主要傳感器之一［8］。

研究［9］顯示TLR4和NF-κB在肝內膽管結石相關的ICC組織中呈高表達。這表明TLR4和NF-κB 在HiBEC癌變的過程中起著重要的作用。TLR4 mAb可以結合HiBEC細胞上的TLR4，從而阻止LPS與TLR4的結合，進而抑制LPS誘導的NF-κB的活化及相應炎癥介質的產生。研究［10－11］顯示下調NF-κB的表達可以向下調節炎癥并由此向下調節腫瘤發生的整個過程，因此NF-κB抑制劑具有潛在的預防和治療癌癥的作用。

Yung et al［12］通過體外培養胃癌細胞株TSGH 9201，發現TLR4、p38 MARK和NF-κB的激活可以上調抵抗素誘導的基質細胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）。SDF-1參與了胃癌的發生，刺激血管生成，有利于腫瘤細胞轉移到遠處器官。而TLR4競爭性拮抗劑可以抑制TLR4，下調NF-κB的表達，抑制抵抗素誘導的SDF-1的表達。Yung et al認為抑制TLR4可能是治療抵抗素導致的胃癌的治療方法。本研究顯示，LPS（4 μg／ml）作用于HiBEC 6 h后，TLR4和NF-κB表達水平明顯增加。由此推測HiBEC中LPS的作用機制可能是通過LPS-TLR4-NF-κB通路將LPS刺激信號向細胞內轉導，進而導致NF-κB磷酸化和核轉位［13］。為證實這一推測，本研究將TLR4 mAb作為TLR4的阻斷劑，對LPS-TLR4-NF-κB這一重要通路進行封閉。結果顯示采用LPS（4 μg／ml）作用于TLR4 mAb預處理之后的HiBEC，其TLR4較A組表達下調；且LPS作用于不同質量濃度TLR4 mAb預處理之后的HiBEC，TLR4的表達隨TLR4 mAb濃度的升高而進一步下調，但兩者之間差異無統計學意義。在用LPS對HiBEC進行刺激之前給予TLR4 mAb預處理24 h，則其NF-κB表達較A組下調，提示TLR4 mAb的作用機制可能是通過預先與HiBEC表面的TLR4結合，形成抗原抗體復合物，使得后來的LPS不能與TLR4結合，進而阻斷下游信號轉導通路，影響LPS刺激后產生相應的炎癥因子。本研究還顯示NF-κB在E組中表達較D組下調（P＜0.05），推測可能存在量效關系。以上結果說明LPS可能是通過LPS-TLR4-NF-κB通路上調TLR4和NF-κB的表達，并可能與腫瘤的發生發展有關，而TLR4 mAb可以拮抗LPS對HiBEC的刺激作用，阻止細胞內的信號傳導。

綜上所述，本研究提示LPS作用于體外培養的HiBEC后，TLR4 mRNA和NF-κB mRNA表達上調；使用TLR4 mAb后能拮抗LPS對HiBEC中TLR4 和NF-κB的作用。推測LPS對TLR4和NF-κB的影響可能是通過結合HiBEC表面TLR4來實現，而TLR4 mAb可以封閉細胞膜上的TLR4受體，進而阻止LPS向HiBEC內的信號轉導，下調NF-κB的表達。本研究結果為研制新的抗LPS藥物提供了一定的理論依據；為下一步尋找特異性的藥物阻止受膽管結石長期刺激的膽管壁細胞發生癌變提供前期實驗依據。

［1］ Sempoux C，Jibara G，Ward S C，et al.Intrahepatic cholangiocarcinoma：new insights in pathology［J］.Semin Liver Dis，2011，31 （1）：49-60.

［2］ Tyson G L，El-Serag H B.Risk factors for cholangiocarcinoma ［J］.Hepatology，2011，54（1）：173－84.

［3］ Chen S，Xiong J，Zhang Y，et al.Wogonin inhibits LPS-induced inflammatory responses in rat dorsal root ganglion neurons via inhibiting TLR4-MyD88-TAK1-mediated NF-κB and MAPK signaling pathway［J］.Cell Mol Neurobiol，2015，35（4）：523－31.

［4］ Zhang S，Yang N，Ni S，et al.Pretreatment of lipopolysaccharide （LPS）ameliorates D-GalN／LPS induced acute liver failure through TLR4 signaling pathway［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（10）：6626－34.

［5］ Park M Y，Mun S T.Carnosic acid inhibits TLR4-MyD88 signaling pathway in LPS-stimulated 3T3-L1 adipocytes［J］.Nutr Res Pract，2014，8（5）：516－20.

［6］ Grivennikov S I，Greten F R，Karin M.Immunity，inflammation and cancer［J］.Cell，2010，140（6）：883－99.

［7］ Basith S，Manavalan B，Yoo T H，et al.Roles of toll-like receptors in cancer：a double-edged sword for defense and offense［J］. Arch Pharm Res，2012，35（8）：1297－316.

［8］ Aggarwal B B，Sung B.The relationgship between inflammation and cancer is analogousto that between fuel and fire［J］.Oncology （Williston Park），2011，25（5）：414－8.

［9］ 陳 佳，余宏鑄，王正林，等.TLR4和NF-κB在肝內膽管結石相關的肝內膽管細胞癌中的表達及臨床意義［J］.安徽醫科大學大學學報，2014，49（5）：625－8.

［10］Gupta S C，Kim J H，Prasad S，et al.Regulation of survival，proliferation，invasion，angiogenesis，and metastasis of tumor cells through modulation of inflammatory pathways by nutraceuticals ［J］.Cancer Metastas Rev，2010，29（3）：405－34.

［11］Gupta S C，Sundaram C，Reuter S，et al.Inhibiting NF-κB activation by small molecules as a therapeutic strategy［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1799（10－12）：775－87.

［12］Hsieh Y Y，Shen C H，Huang W S，et al.Resistin-induced stromal cell-derived factor-1 expression through Toll-like receptor 4 and activation of p38 MAPK／NF-κB signaling pathway in gastric cancer cells［J］.J Biomed Sci，2014，21：59.

［13］Lorne E，Dupont H，Abraham E.Toll-like receptors 2 and 4：initiators of non-septic infammation in critical care medicine［J］.Intensive Care Med，2010，36（11）：1826－35.

Effect of TLR4 mAb on the normal intrahepatic of bile duct epithelial cells of human LPS-TLR4-NF-κB pathway

Liu Hui，Yu Hongzhu，Han Long，et al
（Dept of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the expression of Toll-like receptor 4（TLR4），nuclear factor-κB（NF-κB）induced by lipopolysaccharide（LPS）and Toll-like receptor 4 monoclonal antibodies（TLR4 mAb）in normal human intrahepatic biliary epithelial cells（HiBEC）in vitro.MethodsWe cultured HiBEC in vitro.The cells were stimulated by LPS and different concentrations of TLR4 mAb.The levels of mRNA expression of TLR4 and NF-κB were detected by reverse transcription PCR（RT-PCR）.ResultsLPS increased the mRNA expression of TLR4 and NF-κB（P＜0.05）.TLR4 mAb reduced the mRNA expression of TLR4 and NF-κB（P＜0.05）after LPS-stimulated HiBEC.High concentrations of TLR4 mAb reduced the mRNA expression of NF-κB（P＜0.05）after LPS-stimulated HiBEC in vitro.ConclusionThe mRNA expression of TLR4 and NF-κB is increased afer LPS-stimulated Hi-BEC.TLR4 mAb antagonize the role of LPS on TLR4 and NF-κB，and reduce the mRNA expression of TLR4 and NF-κB.

lipopolysaccharide；Toll-like receptor 4 monoclonal antibodies；Toll-like receptor 4；nuclear factorκB

R 349.54

A

1000－1492（2015）07－0946－04

2015－04－23接收

2013年安徽省年度重點科研計劃項目（編號：1301043034）

安徽醫科大學第一附屬醫院肝膽外科，合肥 230022

劉 輝，男，碩士研究生；余宏鑄，男，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：hong-Zhu.620929＠aliyun.com