茵陳中6，7-二甲氧基香豆素在MDCK模型中的吸收機制研究

李楊楊，黃 成，孟曉明，陳昭琳，馬陶陶，李 俊

茵陳中6，7-二甲氧基香豆素在MDCK模型中的吸收機制研究

李楊楊，黃 成，孟曉明，陳昭琳，馬陶陶，李 俊

目的基于馬丁達比犬的腎近曲小管上皮（MDCK）細胞模型研究茵陳中6，7-二甲氧基香豆素的吸收機制。方法考察時間、藥物濃度（12.5、25、50、100、200 μmol／L）、溫度（4、37℃）和抑制劑（碘乙酰胺、維拉帕米、MK571）對6，7-二甲氧基香豆素吸收和轉運的影響。采用高效液相色譜法（HPLC）檢測6，7-二甲氧基香豆素的濃度，計算出表觀滲透系數(shù)（Papp），并分析其吸收機制。結果根據(jù)Papp得出6，7-二甲氧基香豆素在MDCK細胞模型上的轉運量呈時間和濃度依賴性且不同濃度下的Papp（B-A）／Papp（A-B）≈1，4、37℃和加入抑制劑碘乙酰胺后，6，7-二甲氧基香豆素的吸收Papp（A-B）之間差異無統(tǒng)計學意義，37℃和加入外排蛋白抑制劑維拉帕米、MK571后，6，7-二甲氧基香豆素的外排Papp（B-A）之間差異無統(tǒng)計學意義。結論6，7-二甲氧基香豆素在MDCK細胞模型上表現(xiàn)為濃度依賴的單純擴散。

MDCK；6，7-二甲氧基香豆素；HPLC；單純擴散

6，7-二甲氧基香豆素是常用中藥茵陳的主要有效成分之一，茵陳為菊科植物濱蒿或茵陳蒿的地上干燥部分，《中國藥典》2010年版（一部）收載，具有清濕熱、退黃疸的功效，臨床上常用做保肝中藥［1］，其主要藥效物質基礎為香豆素類化合物。研究［2］表明6，7-二甲氧基香豆素具有抗凝血、降血脂、促血管舒張、抗氧化、抗炎等生物學特性。目前關于6，7-二甲氧基香豆素的吸收機制研究未見文獻報道。馬丁達比犬腎近曲小管上皮（Madin Darby canine kidney，MDCK）細胞模型被用來研究小腸上皮細胞藥物轉運和代謝的體外模型，已廣泛應用于口服藥物的篩選和研究藥物腸吸收的過程，成為了研究藥物吸收較適合的模型［3］。該實驗用MDCK細胞單層模型研究6，7-二甲氧基香豆素的吸收機制，考察時間、藥物濃度、溫度以及相關抑制劑對6，7-二甲氧基香豆素雙向轉運轉運的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 6，7-二甲氧基香豆素（純度＞98%，批號：ZL140316982）購自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司；碘乙酰胺（批號：H1420070）購自美國aladdin公司；MK571購自美國Sigma公司（純度＞95%，批號：103M4621V）；橙皮苷（內(nèi)標，批號：110721－200613）、鹽酸維拉帕米（批號：100223－200102）購自中國藥品生物制品檢定所；胎牛血清購自杭州四季青公司；甲醇（色譜純）購自美國Tedia公司；Hank′s溶液（Hank′s balanced salt solution，HBSS）購自上海碧云天生物技術有限公司；MEM培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司。

1.1.2 儀器 四元低壓梯度高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（型號LC-20A）購自日本島津公司；臺式高速冷凍離心機（型號Neofuge 23R）購自香港力康發(fā)展有限公司；分析天平（型號FA2004N）購自上海精密科學有限公司；超純水機（型號ROIS5 30 L）、細胞電壓電阻儀（Millicell-ERS）、懸掛式培養(yǎng)皿（Millicell-CPI）均購自美國Millipore公司；細胞培養(yǎng)箱（型號Napco-6100）購自美國杜邦公司；酶標儀（型號MK3）購自荷蘭雷勃公司。

1.1.3 細胞株 MDCK細胞株（american type culture collection，ATCC）由浙江工業(yè)大學宋必衛(wèi)教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 單層細胞模型的建立 將MDCK細胞培養(yǎng)于MEM（含10%胎牛血清、100 U／ml青霉素和100 U／ml鏈霉素雙抗液）中，置37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。MDCK細胞按每孔密度5×103個／cm2接種到含有Millicell CPI膜的24孔板中，在A側加入培養(yǎng)基0.5 ml，B側加入1.5 ml后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～6 d，期間用Millicell-ERS測跨細胞單層膜電阻（transepithelial electrical resistance，TEER）當每孔的TEER＞140 Ω·cm2，便能進行跨膜轉運實驗。

1.2.2 MTT法 將濃度為1×105個／ml的細胞懸液接種到96孔板中，每孔加入0.1 ml細胞懸液，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，給藥孔分別加入6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μmol／L濃度溶液各100 μl，空白對照孔只加含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，調(diào)零孔加PBS，每組設置5個復孔，培養(yǎng)24 h后，各孔加入20 μl濃度為5 g／L的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去上清液并加入150 μl的DMSO，振蕩10 min，并用酶標儀檢測其在492 nm處的吸光度（absorbance，A）值，結果用細胞存活率表示。細胞存活率（%）＝（給藥孔A均值－調(diào)零孔A均值）／（空白對照孔A均值－調(diào)零孔A均值）×100%。

1.2.3 轉運實驗方法 選取TEER＞140 Ω·cm2的24孔板，用HBSS清洗2遍，并孵育30 min后加藥。轉運分為吸收（CPI的A側到B側的轉運）和外排（CPI的B側到A側的轉運）兩組實驗，吸收實驗步驟為：A側分別加入0.6 ml不同濃度的藥物，B側加入1.2 ml HBSS，放入恒溫培養(yǎng)箱，于30、60、90、120 min時間點從B側取樣120 μl，并在B側補充120 μl HBSS。分泌實驗步驟：B側分別加入1.2 ml不同濃度的藥物，A側加入0.6 ml HBSS，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于30、60、90、120 min時間點從A側取樣120 μl，并在A側補充1.2 ml HBSS，每組試驗平行3份，為確定細胞單層沒有破損，實驗結束時需再次測量各孔的TEER值。

1.2.4 分析方法 精密稱取適量6，7-二甲氧基香豆素對照品，用DMSO溶解，用培養(yǎng)基溶解并稀釋成12.5、25、50、100、200 μmol／L系列溶液。取樣品溶液100 μl，加入內(nèi)標橙皮苷溶液10 μl和甲醇溶液90 μl，渦旋，12 000 r／min離心3 min，吸取上清液100 μl，進樣。色譜柱為Hypersil ODS column （250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇溶液－水溶液（30∶70），檢測波長：343 nm，流速為1.0 ml／min，進樣量為20 μl，柱溫為40℃。

1.3 統(tǒng)計學處理用藥物的表觀滲透系數(shù)（Papp）值進行數(shù)據(jù)處理。兩組的比較用t檢驗，數(shù)據(jù)均以ˉx ±s表示。Papp＝（dQ／dt）／（A×Co）。式中dQ／dt代表單位時間藥物轉運量（μmol／s）；A代表Millicell膜面積（1.33 cm2）；C0代表藥物初濃度（μmol／L）。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 專屬性試驗 空白HBSS、含6，7-二甲氧基香豆素和內(nèi)標橙皮苷對照品的HBSS、實驗樣品的色譜圖見圖1。HBSS、6，7-二甲氧基香豆素、橙皮苷互不干擾測定。

2.1.2 線性關系的考察 取6，7-二甲氧基香豆素備液適量，用HBSS稀釋成3.9、7.8、15.6、31.25、62.5、125、250、500 μmol／L的對照品系列溶液，按“1.2.4”處理并進樣，測定峰面積并繪制標準曲線，得標準曲線Y＝12.018X＋0.073，r＝0.991（X為6，7-二甲氧基香豆素濃度，Y為6，7-二甲氧基香豆素與內(nèi)標的峰面積）。可以看出6，7-二甲氧基香豆素在濃度3.9～500 μmol／L內(nèi)與峰面積之間線性關系良好。

2.1.3 精密度與準確度 取6，7-二甲氧基香豆素備液適量，用HBSS稀釋成7.8、31.25、125 μmol／L系列的質控樣品（n＝5），按“1.2.4”處理并進樣，1 d內(nèi)連續(xù)測定5次，算出日內(nèi)精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為1.80%、1.58%、1.75%，并連續(xù)測定5 d，算出日間精密度RSD值分別為2.41%、1.95%、1.86%，符合小于10%的要求。準確度分別為93.56%、91%、105.93%，符合85%～115%的要求。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 取6，7-二甲氧基香豆素備液適量，用HBSS稀釋成7.8、31.25、125 μmol／L系列的質控樣品（n＝5），算出室溫放置24 h和－20℃存放20 d兩者的穩(wěn)定性進行考察，按“1.2.4”處理并進樣，測定6，7-二甲氧基香豆素的濃度，計算出24 h的RSD值分別為3.53%、2.75%、2.52%，－20℃的RSD值分別為3.17%、2.48%、2.13%，均符合小于5%的要求。

2.1.5 6，7-二甲氧基香豆素對MDCK細胞的毒性作用 MTT結果表明，6，7-二甲氧基香豆素濃度在6.25～200 μmol／L時，細胞存活率都大于70%以上，可以用于轉運實驗。見圖2。

2.2 6，7-二甲氧基香豆素的雙向跨膜轉運不同濃度下6，7-二甲氧基香豆素在MDCK模型上的累積透過量隨時間變化的曲線見圖3。6，7-二甲氧基香豆素的累積透過量和時間呈正相關性，且初始濃度越大累計透過量越多。雙向轉運的Papp值見表1。6，7-二甲氧基香豆素的Papp（B－A）與Papp（A－B）不隨濃度的增加而升高，且比值均≈1，表明其轉動主要機制為被動擴散。見表1。

表1 濃度對6，7-二甲氧基香豆素Papp的影響（±s，n＝3）

表1 濃度對6，7-二甲氧基香豆素Papp的影響（±s，n＝3）

濃度（μmol／L）Papp（×10－5cm／s）A→BB→A Papp（B－A）／Papp（A－B）12.52.347±0.0642.139±0.6310.911 252.581±0.2942.368±0.4440.917 502.270±0.2252.141±0.2120.943 1001.704±0.3611.699±0.2240.997 2002.014±0.2831.887±0.1520.937

2.3 溫度對6，7-二甲氧基香豆素跨膜轉運的影響固定6，7-二甲氧基香豆素濃度為50 μmol／L，4℃、37℃條件下6，7-二甲氧基香豆素Papp（A－B）分別為（1.961±0.527）×10－5cm／s、（2.270±0.225）× 10－5cm／s，差異無統(tǒng)計學意義（t＝2.316，P＞0.05）；Papp（B－A）分別為（1.967±0.648）×10－5cm／s、（2.141±0.212）×10－5cm／s，差異無統(tǒng)計學意義（t＝2.441，P＞0.05），表明6，7-二甲氧基香豆素的跨膜轉運不會受到載體的影響。見圖4。

2.4 碘乙酰胺對6，7-二甲氧基香豆素跨膜轉運的影響為了進一步證明6，7-二甲氧基香豆素的轉運不受載體的參與，本實驗加入三磷酸腺苷耗竭劑碘乙酰胺（5 mmol／L），加入碘乙酰胺，6，7-二甲氧基香豆素A→B（t＝0.997，P＞0.05）和B→A（t＝1.21，P＞0.05）的Papp差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 碘乙酰胺對6，7-二甲氧基香豆素Papp的影響（n＝3，±s）

表2 碘乙酰胺對6，7-二甲氧基香豆素Papp的影響（n＝3，±s）

項目轉運方向Papp（×10－5cm／s）6，7-二甲氧基香豆素A→B2.270±0.225 B→A2.141±0.212 6，7-二甲氧基香豆素＋碘乙酰胺A→B2.549±0.178 B→A2.162±0.145

2.5 抑制劑對6，7-二甲氧基香豆素跨膜轉運的影響固定6，7-二甲基香豆素濃度為50 μmol／L，加入維拉帕米、MK571后，6，7-二甲氧基香豆素的Papp（A－B）分別為（2.052±0.129）×10－5cm／s、（2.256±0.289）×10－5cm／s，與37℃的Papp（A－B）（2.270±0.225）×10－5cm／s相比差異無統(tǒng)計學意義（t＝－1.444、－0.36，P＞0.05）；Papp（B－A）分別為（2.390±0.208）×10－5cm／s、（2.168±0.311）× 10－5cm／s，與37℃的Papp（B－A）（2.141±0.212）× 10－5cm／s相比差異無統(tǒng)計學意義（t＝1.21、1.000，P＞0.05）。見圖5。

3 討論

藥物跨膜轉運過程是藥物體內(nèi)過程的前提，也是其發(fā)揮藥物活性的必需，所以透膜過程貫穿著藥物在體內(nèi)的整個過程，研究藥物的跨膜轉運機制對提高藥物的生物利用度和藥效具有重要意義［4］。目前廣泛應用的是人結腸癌細胞模型和MDCK模型。MDCK細胞模型最早由Leighton et al［5］建立，MDCK接種在半透膜上之后能分化成柱狀單層上皮并形成致密的連接，整個過程僅需要2～6 d。MDCK細胞具有生長快和細胞亞型少的優(yōu)勢，這使得實驗周期能夠大大縮短并且實驗結果重現(xiàn)性較高［6］。本實驗利用MDCK細胞模型研究6，7-二甲氧基香豆素在MDCK單層細胞中的吸收機制，隨著濃度和時間的增加，轉運量呈線性增加且兩個方向各濃度的Papp值并無顯著差異，基本保持恒定，即Papp（B－A）／Papp（A－B）≈1，結果表明6，7-二甲氧基香豆素的吸收轉運可能以被動擴散為主。眾所周知，對溫度敏感是載體介導主動轉運的共同特征，當溫度下降時，載體活性逐漸減弱或者失活。改變溫度對6，7-二甲氧基香豆素吸收沒有影響，表明其吸收沒有載體蛋白的參與。另外，在轉運機制探討方面，已知碘乙酰胺具有抑制能量代謝并且耗竭細胞內(nèi)儲存ATP的作用［7］，在MDCK細胞單層用5 mmol／L的碘乙酰胺處理實驗中，6，7-二甲氧基香豆素的吸收和外排皆未受到影響，提示其轉運無能量的參與。P-糖蛋白和多藥耐藥相關蛋白是影響藥物轉運通過細胞膜的一個重要因素，兩者主要功能是外排各種外來異物，保護機體不受外來異物的侵擾。已知維拉帕米是P-糖蛋白外排抑制劑，MK-571是多藥耐藥相關蛋白-2外排抑制劑，兩者對6，7-二甲氧基香豆素的轉運皆沒有影響。這些結果進一步證明了6，7-二甲氧基香豆素在MDCK細胞模型上是通過濃度依賴的單純擴散機制進行的。6，7-二甲氧基香豆素Papp大于1.0×10－5cm／s屬于吸收中等的化合物，推斷其吸收率大于70%。

［1］ 孟繁欽，吳宜燕，雷 濤，等.茵陳的藥理作用及臨床應用進展［J］.牡丹江醫(yī)學院學報，2009，30（1）：46－8.

［2］ 楊 艷，王慶偉，張 琰.濱篙內(nèi)酯的研究進展［J］.中國藥業(yè)，2011，20（19）：1－3.

［3］ Gartzke D，F(xiàn)ricker G.Establishment of optimized MDCK cell lines for reliable efflux transport studies［J］.J Pharm Sci，2014，103 （4）：1298－304.

［4］ 韓靜文，李 俊，黃 成，等.梔子苷與梔子柏皮湯中梔子苷在MDCK細胞跨膜轉運模型上的轉運研究［J］.中國藥理學通報，2014，30（4）：468－72.

［5］ Leighton J，Estes L W，Mansukhani S，et al.A cell line derived from normal dog kidney（MDCK）exhibiting qualities of papillary adenocarcinoma and of renal tubular epithelium［J］.Cancer，1970，26（5）：1022－8.

［6］ 孔一帆，李 俊，黃 成，等.基于MDCK的葛根素跨膜轉運機制的研究［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2012，47（12）：1418－22.

［7］ 姚 媛，廖瓊峰，謝智勇，等.新穿心蓮內(nèi)酯在Caco-2細胞單層模型中的吸收機制研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2014，20 （14）：113－6.

Absorption mechanism of 6，7-dimethylesculetin in capillary artemisia in MDCK cell membrane model

Li Yangyang，Huang cheng，Meng Xiaoming，et al
（School of Pharmacy，Anhui Provincial Laboratory on Bioactivity of Natural Products，Anhui Institute of Innovative Drugs，Anhui Medical University，Hefei 230032）

ObjectiveTo study absorption of 6，7-dimethylesculetin in capillary artemisia in MDCK cell membrane model.MethodsThe effects of time，drug concentration，temperatuer and inhibitor on the absorption and transport of 6，7-dimethylesculetin were studied systematically in the MDCK cell membrane.The drug concentration was determined by high performance liquid chromatography to calculate the apparent permeability coefficient（Papp）.Results6，7-dimethylesculetin transport in MDCK cell monolayer was time and concentration dependent.The Papp（B－A）／Papp（A－B）≈1.With the 4℃，37℃and presence of iodoacetamide，the Papp（A－B）of 6，7-dimethylesculetin had no significant difference.With the 37℃and presence of verpamil，MK571，the Papp（B－A）of 6，7-dimethylesculetin also had no significant difference.ConclusionThe transport of 6，7-dimethylesculetin in MDCK cell membrane model is passive diffusion.

MDCK；6，7-dimethylesculetin；HPLC；passive diffusion

R 945

A

1000－1492（2015）07－0973－05

2015－04－08接收

國家自然科學基金（編號：81273526，81202978）

安徽醫(yī)科大學藥學院、安徽天然藥物活性研究省級實驗室、安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性研究院，合肥 230032

李楊楊，男，碩士研究生；李 俊，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：lijun＠ahmu.edu.cn