選擇性β腎上腺素受體激動劑對人滑膜細胞增殖能力的影響

魏 巍，吳華勛，付靜靜，袁平凡，魏偉

選擇性β腎上腺素受體激動劑對人滑膜細胞增殖能力的影響

魏 巍，吳華勛，付靜靜，袁平凡，魏偉

目的觀察β-腎上腺素受體（AR）激動藥對人成纖維樣滑膜細胞（FLS）增殖的作用，探討β-AR信號對人FLS功能的影響。方法組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)人FLS；使用腫瘤壞死因子α（TNF-α）作為刺激劑，MTT法分別檢測β1-AR選擇性激動劑多巴酚丁胺和β2-AR選擇性激動劑沙丁胺醇對人FLS增殖作用的影響，并計算增殖抑制率；使用沙丁胺醇＋β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551觀察其對FLS增殖功能的影響；Western blot法檢測人FLS β-AR、G蛋白偶聯受體激酶2（GRK2）和β抑制蛋白2（β-arrestin2）胞膜蛋白的表達水平。結果TNF-α可以顯著促進人FLS的增殖；β2-AR激動劑沙丁胺醇能明顯抑制FLS的增殖，其拮抗劑ICI 118551能顯著拮抗沙丁胺醇的作用；β1-AR選擇性激動劑多巴酚丁胺對FLS的增殖無顯著影響；TNF-α和沙丁胺醇均能顯著降低β2-AR胞膜表達，上調GRK2、β-arrestin2的胞膜表達。結論β2-AR信號的激活可以抑制FLS增殖；TNF-α和沙丁胺醇可以使GRK2、β-arrestin2的胞膜表達增加，β2-AR胸膜表達下降。

腎上腺素受體；成纖維樣滑膜細胞；沙丁胺醇；增殖

腎上腺素受體（adrenergic receptor，AR）作為神經免疫調節(jié)的關鍵受體，可能參與了類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)生、發(fā)展過程［1］。AR屬于G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）家族，AR分為α1-AR、α2-AR、β-AR。β-AR分為3個亞型，即β1-AR、β2-AR、β3-AR［2］。其中β2-AR在炎癥反應細胞因子網絡中發(fā)揮抗炎作用，可以抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）產生、抑制白細胞黏附、降低毛細血管通透性等［3－4］。β-AR介導的信號通路可能受到G蛋白偶聯受體激酶2（G-protein-coupled receptor kinases，GRK2）和β抑制蛋白2（β-arrestin2）的調節(jié)［5］。β-AR活化后會被GRK2磷酸化，而后β-arrestin 2轉移至細胞膜與磷酸化的受體結合，使該受體與G蛋白脫偶聯，從而促進β-AR內化和脫敏［6］。在β-AR信號轉導中，GRK2／β-arrestin2是β-AR信號轉導的負性調控分子，直接影響下游信號分子的效應［7］。該研究通過觀察β1-AR選擇性激動劑多巴酚丁胺和β2-AR選擇性激動劑沙丁胺醇及其選擇性的受體拮抗劑對人成纖維樣滑膜細胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）的增殖功能等的影響，及β-AR信號在人FLS中的變化，探討β-AR信號對人FLS的調節(jié)作用及部分可能機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2012年8月～2013年8月在安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行膝關節(jié)置換及關節(jié)鏡術中所取的10例正常關節(jié)滑膜組織。全部來源于膝關節(jié)半月板損傷患者，男6例，女4例；年齡18～37（23±5.8）歲，經診斷無其他關節(jié)病變，取正?；そM織，試驗得到所有對象的知情同意。

1.2 試劑β1-AR選擇性激動劑多巴酚丁胺購自浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司；β2-AR選擇性激動劑沙丁胺醇購自上海禾豐制藥有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清（fetal calf serum，FCS）購自美國Hyclone公司；β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551、MTT購自美國Sigma公司，MTT以PBS配制成所需濃度，過濾除菌，現用現配；兔源性抗β1-AR抗體和兔源性抗β2-AR抗體購自美國abcam公司；兔源性抗GRK2抗體和兔源性抗β-arrestin2抗體購自美國Santa Cruz公司；辣根過氧化酶羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；TNF-α購自上海達科為生物制品有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 滑膜細胞分離、培養(yǎng) 采用滑膜細胞的組織塊培養(yǎng)法［8］：將前述收取的滑膜組織放入有PBS的無菌瓶內，在超凈臺內棄PBS，用D-Hank’s液（無Ca2＋、Mg2＋，含青霉素200 mg／L、鏈霉素200 mg／L）反復沖洗后剪成1～2 mm2小塊，用彎頭吸管吸取均勻排列于培養(yǎng)瓶（預先用含20%FCS的DMEM培養(yǎng)液濕潤）的底壁，瓶底朝上，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使其貼壁。輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，使培養(yǎng)液剛剛覆蓋組織塊，每隔2～3 d換1次培養(yǎng)液，觀察到有大量成纖維細胞長出后輕輕去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞快長滿時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代培養(yǎng)，取第3代細胞用于實驗。

1.3.2 FLS增殖反應的測定 采用MTT法檢測增殖反應。人第3代滑膜細胞經0.25%胰蛋白酶消化后，用含20%FCS的DMEM培養(yǎng)液制備細胞懸液（5×106個／ml），加至96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實驗分為：正常組、TNF-α（20 ng／ml）刺激組、TNF-α＋多巴酚丁胺（10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）組、TNF-α＋沙丁胺醇（10－9、10－8、10－7、10－6、10－5mol／L）組，培養(yǎng)12、24、48、72 h。終止培養(yǎng)前4 h各孔加MTT（5 g／L）溶液20 μl繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后棄去上清液，加入DMSO（100 μl／孔），振蕩3 min后于酶標儀490 nm波長處測吸光度（absorbance，A）值。每組以復孔的均值表示其結果。根據以上實驗結果，選擇合適的時間、濃度，給予β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551觀察其對人FLS增殖的影響。

1.3.3 Western blot法檢測FLS的β1-AR、β2-AR、GRK2和β-arrestin2胞膜蛋白的表達 取第3代FLS，以每孔1×106細胞密度接種于6孔板中，實驗分為：正常組、沙丁胺醇（10－6mol／L）組、TNF-α（20 ng／ml）組、TNF-α＋沙丁胺醇（10－6mol／L）組。培養(yǎng)24 h，PBS洗滌細胞2次，加入RIPA裂解液后超聲降解，提取總蛋白，100 000 r／min離心1 h，沉淀物為胞膜蛋白，用裂解液溶解，加入上樣緩沖液煮沸變性后進行SDS-PAEG電泳（5%的濃縮膠和10%的分離膠），轉膜，5%的脫脂奶粉37℃封閉2 h，分別加入抗β1-AR、β2-AR、GRK2或β-arrestin2（1∶1 000）抗體，內參用β-actin單克隆抗體，4℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標記的相應二抗（1∶30 000），37℃孵育2 h，ECL法顯影，分析條帶灰度值。實驗重復3次，以目的條帶與β-actin條帶的灰度比值來表示蛋白相對表達量［9］。

1.4 統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，數據以±s表示。組間比較用方差分析。

2 結果

2.1 β-AR選擇性激動劑對FLS增殖能力的影響與正常組比較，TNF-α（20 ng／ml）可以明顯促進人FLS的增殖能力，沙丁胺醇在12、24、48 h可不同程度的抑制FLS亢進的增殖功能，而多巴酚丁胺對FLS的增殖無明顯影響。沙丁胺醇（10－6mol／L）在24 h有較高的增殖抑制率。見圖1、2。

2.2 β2-AR選擇性拮抗劑對人FLS增殖能力的影響與正常組比較，TNF-α（20 ng／ml）可以顯著促進FLS的增殖（P＝0.004），沙丁胺醇（10－6mol／L）能顯著抑制FLS亢進的增殖能力（P＝0.022），β2-AR選擇性拮抗劑ICI 118551（10－6mol／L）能顯著拮抗沙丁胺醇（10－6mol／L）對FLS的抑制作用（P ＝0.006）。見圖3。

2.3 Western blot法檢測FLS β1-AR、β2-AR、GRK2、β-arrestin2的變化與正常組比較，TNF-α（20 ng／ml）可以顯著降低胞膜中β2-AR的表達（P ＝0.007）；升高胞膜中GRK2（P＝0.034）、β-arrestin2（P＝0.008）的表達。與TNF-α單獨刺激組比較，TNF-α（20 ng／ml）＋沙丁胺醇（10－6mol／L）組可以進一步降低胞膜中β2-AR的表達（P＝0.023）；升高胞膜中GRK2（P＝0.015）、β-arrestin2（P＝0.034）的表達。見圖4。

3 討論

β-AR是一類典型的GPCRs，是人體內具有復雜生理功能的受體，與許多疾病的發(fā)生密切相關，如心血管疾病、自身免疫病等，其功能受GRK2等的調節(jié)。β2-AR以激動劑依賴方式與GRK2結合并磷酸化，另一蛋白家族視紫紅質抑制蛋白（arrestin）與磷酸化的β-AR結合，得β-AR與Gαs蛋白解偶聯，導致受體功能減退（即同源脫敏）［10］，通過G蛋白-AC-cAMP信號轉導通路，啟動信號轉導一系列反應，將胞外信號傳達到胞內，調節(jié)細胞的生理功能［8］。其中β2-AR主要偶聯Gs蛋白，該受體的活化能激活AC，升高cAMP的水平，進一步激活PKA而發(fā)揮效應，如抑制白細胞黏附、降低毛細血管通透性等。β2-AR的激活可以抑制很多炎癥反應，如在自身免疫性心肌炎中，β2-AR信號通過調節(jié)T細胞的功能發(fā)揮抑制作用［11］。那么β2-AR信號是否對FLS的功能具有調節(jié)作用呢？本研究結果提示β2-AR激動藥可以抑制FLS增殖，而β1-AR激動藥對FLS增殖無明顯影響。

TNF-α（20 ng／ml）可以顯著降低胞膜中β2-AR的表達，升高胞膜中GRK2、β-arrestin2的表達；TNF-α＋沙丁胺醇（10－6mol／L）可以進一步降低胞膜中β2-AR的表達，升高胞膜中GRK2、β-arrestin2的表達，兩者作用趨勢一致，但TNF-α刺激增殖，而沙丁胺醇抑制增殖。因為沙丁胺醇是β2-AR選擇性激動劑，刺激β2-AR，升高cAMP的水平?？赡芘ccAMP升高，抑制滑膜細胞增殖有關。

GRK2、β-arrestin2是β-AR脫敏典型的負性調節(jié)蛋白。β-AR被配體激活后，會被GRK2在絲、蘇氨酸位點快速磷酸化，磷酸化的β-AR與轉移至胞膜的β-arrestin2結合，使該受體與G蛋白脫偶聯，從而促進β-AR的內化和脫敏，通過脫敏β-AR，終止G蛋白介導的下游信號，影響cAMP的水平［12］。本實驗結果顯示，TNF-α活化后的FLS經沙丁胺醇作用后，由于脫敏作用β2-AR胞膜表達明顯下降，而β2-AR負性調節(jié)蛋白GRK2、β-arrestin2在胞膜中表達顯著升高，提示GRK2、β-arrestin2轉膜的增加，導致β2-AR脫敏的增強，可能是β2-AR胞膜表達下降主要原因。

［1］ Koopman F A，Stoof S P，Straub R H，et al.Restoring the balance of the autonomic nervous system as an innovative approach to the treatment of rheumatoid arthritis［J］.Mol Med，2011，17（9－10）：937－48.

［2］ 汪慶童，馬昱琨，黃 蓓，等.芍藥苷通過調節(jié)前列腺素E2受體抑制大鼠成纖維滑膜細胞增殖［J］.中國藥理學通報，2012，28（1）：43－7.

［3］ Zhu W，Woo A Y，Zhang Y，et al.β-adrenergic receptor subtype signaling in the heart：from bench to the bedside［J］.Curr Top Membr，2011，67：191－204.

［4］ Chottová D M，Slavíková J.Adrenergic regulation of the mammalian heart［J］.Cesk Fysiol，2011，60（1）：14－9.

［5］ Mishima K，Otani H，Tanabe T，et al.Molecular mechanisms for alpha2-adrenoceptor-mediated regulation of synoviocyte populations ［J］.Jpn J Pharmacol，2001，85（3）：214－26.

［6］ Homan K T，Glukhova A，Tesmer J J.Regulation of G proteincoupled receptor kinases by phospholipids［J］.Curr Med Chem，2013，20（1）：39－46.

［7］ Lymperopoulos A.GRK2 and β-arrestins in cardiovascular disease：Something old，something new［J］.Am J Cardiovasc Dis，2011，1（2）：126－37.

［8］ Han S O，Kommaddi R P，Shenoy S K.Distinct roles for β-arrestin2 and arrestin-domain-containing proteins in β2adrenergic receptortrafficking［J］.EMBO Rep，2013，14（2）：164－71.

［9］ Morris A J，Malbon C C.Physiological regulation of G proteinlinked signaling［J］.Physiol Rev，1999，79（4）：1347－430.

［10］Zhao W，Tong T，Wang L，et al.Chicken type II collagen induced immune tolerance of mesenteric lymph node lymphocytes by enhancing beta2-adrenergic receptor desensitization in rats with collageninduced arthritis［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（1）：12－8.

［11］Zhang P，He X，Tan J，et al.β-arrestin2 mediates β2adrenergic receptor signaling inducing prostate cancer cell progression［J］. Oncol Rep，2011，26（6）：1471－7.

［12］趙 偉，童 彤，馬 勇，等.雞Ⅱ型膠原對膠原性關節(jié)炎大鼠腸系膜淋巴結β2腎上腺素受體脫敏的影響［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2011，46（3）：249－53.

The effects of the selective β-adrenergic receptor agonists on the ability of human synovial cell proliferation

Wei Wei，Wu Huaxun，Fu Jingjing，et al
（Institute of Clinical Pharmacology，Anhui Medical University，Key Laboratory of Anti-inflammatory and Immune Medicine of Education Ministry，Hefei 230032）

ObjectiveTo observe the function of β-adrenergic receptor（AR）agonists on human fibroblasts synoviocytes（FLS）proliferation and explore the effect of β-AR signaling on FLS function.MethodsTissue culturing method cultured human FLS；using TNF-α as a stimulant；MTT method was used to detect the effect of β1-AR selective agonist dobutamine and β2-AR selective agonist salbutamol on the proliferation of human FLS，and calculate the proliferation inhibition rate.β2-AR selective antagonist ICI 118551 was used to observe the effect on FLS proliferation；Western blot method could detect cell membrane protein expression level belonged to FLS β-AR，GRK2 and β-arrestin2 on human.ResultsTNF-α could significantly promote the proliferation of FLS on human，β2-AR agonist salbutamol could significantly inhibit the proliferation of FLS，and its antagonist ICI 118551 could significantly inhibit salbutamol action.β1-AR selective agonist dobutamine had no significant effect on the proliferation of FLS；TNF-α and salbutamol significantly decreased β2-AR expression of cell membrane，and up-regulated GRK2 and β-arrestin2 expression in cell membrane.ConclusionThe activation of β2-AR signal can inhibit the proliferation of FLS；TNF-α and salbutamol can increase the expression of GRK2，β-arrestin2，and decrease the expression of β2-AR in cell membrane.

adrenergic receptor；fibroblast-like synoviocytes；albuterol sulfate；desensitization

R 967

A

1000－1492（2015）07－0978－04

2015－03－20接收

國家自然科學基金（編號：81173075，81330081，81302784）；安徽省科技攻關計劃項目（編號：1301042098）

安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所、抗炎免疫藥物育部重點實驗室，抗炎免疫藥物協同創(chuàng)新中心，合肥 230032

魏 巍，女，碩士研究生；魏 偉，男，博士，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：wwei＠ahmu.edu.cn