生長激素受體在宮腔粘連患者子宮內膜組織中的表達及意義

任 娟，衛 兵，宋恩學，王文艷，張麗麗

生長激素受體在宮腔粘連患者子宮內膜組織中的表達及意義

任 娟，衛 兵，宋恩學，王文艷，張麗麗

目的探討生長激素受體（GHR）在宮腔粘連（IUA）患者子宮內膜組織中的表達及意義。方法通過免疫組化MaxVision兩步法和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法分別檢測IUA患者（研究組）和非IUA患者（對照組）子宮內膜組織中GHR蛋白和GHR mRNA的表達情況。結果研究組GHR蛋白表達、GHR mRNA和對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。子宮內膜腺體與子宮內膜間質中GHR蛋白表達比較差異有統計學意義（P＜0.05）。結論IUA患者子宮內膜組織中GHR的表達低于非IUA患者，而且這種表達在子宮內膜腺體中較多，在子宮內膜間質中較少，為IUA患者在宮腔粘連分離術術后使用生長激素提供一定的理論參考。

宮腔粘連；生長激素；生長激素受體

宮腔粘連（intrauterine adhesions，IUA）臨床主要表現為月經量減少甚至閉經、周期性下腹痛、不孕、反復流產、產后胎盤粘連甚至植入等［1］。近年來IUA患病率逐年增加，IUA已嚴重影響著現代女性的生活質量和生育要求。IUA的治療主要包括經宮腔鏡下宮腔粘連分離術［2］（transcervical resection of adhesions，TCRA）和術后應用雌孕激素促子宮內膜生長。研究［3－4］報道，生長激素（growth hormone，GH）在體外受精－胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）中對反應不良性子宮內膜和子宮內膜反應不良性閉經中都有促進子宮內膜發育的作用，這些研究均提示GH可能促進子宮內膜的生長。部分研究者在此基礎上試圖加用GH來提高IUA治療的效果［5］，但目前關于GH研究主要偏于臨床，尚缺乏基礎研究的證據。該研究通過免疫組化MaxVision兩步法和實時熒光定量PCR（quantitative real time-PCR，qRT-PCR）法，研究生長激素受體（growth hormone receptor，GHR）在IUA和非IUA患者子宮內膜組織中的表達情況，為IUA患者TGRA術后使用GH提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2013年11月～2014年5月在安徽醫科大學第二附屬醫院行宮腔鏡檢查并確診為IUA患者28例作為研究組，年齡20～35 （29.62±2.52）歲。同期因其他原因（子宮縱隔、不孕或節育器嵌頓）行宮腔鏡檢查確診為非IUA患者22例作為對照組，年齡20～40（28.80±3.34）歲，并且這些非IUA患者既往都有過宮腔操作史。

1.1.2 主要手術設備 宮腔鏡及冷光源、腹腔鏡、異物鉗（德國STORZ公司）；監視器（日本SONY公司）；液體膨宮泵（德國Aesculap公司）；熒光定量PCR儀（美國Thermo公司）；微孔板迷你離心機（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.1.3 主要試劑 免疫組化一抗：兔抗人GHR單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；二抗：即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒（鼠／兔）（福州邁新生物技術開發有限公司）；TRIzol試劑和引物（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（美國Thermo公司）；QuantiFast SyBr Green PCR kit（德國Qiagen公司）；核酸染料（上海賽百盛公司）。

1.1.4 術前準備 患者空腹狀態于上午9時前抽取靜脈血檢查GH均未見異常，閉經者手術時間不受限制，月經減少者在卵泡期手術。

1.1.5 標本采集 兩組患者均行宮腔鏡檢查，在檢查中或TCRA操作過程中，視需要在正常子宮內膜組織中，用異物鉗鉗取適量（質量約20 mg）的內膜組織作為標本。

1.2 檢測方法

1.2.1 免疫組化MaxVision兩步法 ①取存檔蠟塊，連續切片4 μm，貼片，65℃溫箱烤片2 h，二甲苯脫蠟；②檸檬酸鹽緩沖液高壓抗原修復，PBS沖洗3次，每次3 min；③免疫組化染色按MaxVision兩步法常規流程進行切片中滴加一抗（兔抗人GHR單克隆抗體以1∶400稀釋），4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min，去除一抗后滴加二抗，試劑盒37℃溫箱中孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；④滴加新鮮配制的DAB顯色；⑤清水沖洗，蘇木精淺染，清水沖洗還藍，梯度乙醇溶液脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS代替一抗作為陰性對照，其余操作流程完全相同。

1.2.2 免疫組化結果判斷及半定量分析 將制好的切片置顯微鏡下觀察，每個樣本隨機選取5個不重疊400倍視野進行測量，陽性信號為棕黃色或棕褐色，根據陽性信號的強弱將結果分為弱、中、強三級，并分別給予1～3分：1分：無信號或信號很弱；2分：信號中等呈淡黃色或棕黃色；3分：信號很強呈棕褐色。根據陽性細胞百分率分別給予1～3分：1分：陽性率≤20%；2分：陽性率21%～70%；3分：陽性率71%～100%。上述兩項評分相加作為每例的總積分。結果判定：總積分1～2分為陰性（－），3～4分為陽性（＋），5～6分為強陽性（＋＋）。

1.2.3 qRT-PCR法 ①從子宮內膜組織中提取RNA：取子宮內膜組織約20 mg經液氮研磨后加入1 ml TRIzol裂解；加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩；4℃12 000 r／min離心15 min，取上清液，加入等體積異丙醇沉降；4℃、12 000 r／min離心10 min，棄上清液，加入1 ml 75%乙醇溶液；4℃、12 000 r／min離心5 min，棄上清液，干燥RNA沉淀；加入20～50 μl DEPC水，55℃促溶10 min，－80℃保存備用；②RNA的濃度及純度的測定：分別測定光密度（optical density，OD）值OD260和OD280以計算RNA樣品的濃度和純度；③樣品cDNA合成：在0.2 ml無RNase PCR管中，加入總RNA（質量為2 μg）、10 μmol／L Oligo 1 μl、DEPC水補足至12 μl，輕輕混勻、點動離心；PCR儀上65℃加熱5 min，立即冰浴3 min；在0.2 ml無RNase PCR管中加入5×Reaction Buffer 4.0 μl、10 mmol／L dNTP Mix 2 μl、RibolockTMRnase inhibitor 1 μl、RevertAidTMM-MuLV Reverse Transcniptase 1 μl；RCR儀上42℃加熱60 min，70℃持續5 min，取出上述反應液，即為cDNA，－80℃保存備用；④熒光定量PCR反應（SYBR GREEN方法）：取出上述反應液1 μl作為熒光定量的模板，反應體系如下：2×SYBR Green mixture 5 μl、上游引物（10 μmol／L）和下游引物（10 μmol／L）各1 μl、cDNA 1 μl、無RNA酶水2 μl，總共10 μl。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s、60℃退火、延伸30 s，共40個循環。本實驗所用人類基因擴增引物序列見表1。

表1 本實驗所用人類基因擴增引物

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，數據計量資料采用±s表示。qRT-PCR分析所采用的指標為：2－ΔΔCt。計量資料采用兩獨立樣本t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 子宮內膜腺體與子宮內膜間質中GHR蛋白表達水平比較免疫組化法檢測結果顯示：子宮內膜腺體中陽性細胞30例，陰性20例，陽性細胞率為60%；子宮內膜間質中陽性細胞18例，陰性32例，陽性細胞率為36%；兩部位GHR蛋白比較差異有統計學意義（χ2＝5.769，P＝0.016）。圖1A：PBS陰性對照，子宮內膜腺細胞和間質細胞均呈陰性表現；圖1B：研究組GHR蛋白陽性染色主要定位于子宮內膜腺細胞的細胞質中，呈淡黃色（＋），而子宮內膜間質細胞（－）；圖1C：對照組GHR蛋白陽性染色定位于子宮內膜腺細胞和間質細胞的細胞膜和細胞質中（主要定位在細胞質）均呈棕褐色（＋＋）；圖1B和圖1C中GHR蛋白陽性染色都呈彌漫性分布，如風塵狀。

2.2 研究組和對照組子宮內膜組織中GHR蛋白表達水平比較免疫組化法檢測結果顯示研究組GHR蛋白表達水平低于對照組（1.70±0.57 vs 2.77±0.75），兩組比較差異有統計學意義（t＝3.373，P＜0.05）。

2.3 研究組和對照組子宮內膜組織中GHR mRNA表達水平比較qRT-PCR法檢測結果顯示研究組（16例）的GHR mRNA表達水平低于對照組（14例）（0.64±0.21 vs 1.00±0.33），兩組比較差異有統計學意義（t＝2.329，P＜0.05）。β-actin、GHR熔解曲線均呈單一峰，并且解鏈溫度在80℃左右，說明產物單一，引物特異性較好，得出的數據可信。見圖2。

3 討論

成熟的人GHR分子是一個含620個氨基酸的單鏈糖蛋白，其中N端246個氨基酸含5個潛在的糖基化位點，位于細胞外，構成激素結合結構域，C 端350個氨基酸位于胞內，構成信號轉導結構域［6］。GH是由腦垂體前葉嗜酸性細胞分泌的一種單一肽鏈的蛋白質激素，是一種具有廣泛生理功能的生長調節激素，在女性人體發育時和雌激素一起促進子宮內膜的生長發育。GH發揮功能主要經由兩個途徑：一是誘導肝細胞、肌細胞產生生長介素（somatomedin，SM），再經由SM間接起作用；二是直接作用于靶細胞產生生理效應［7］。無論哪一種方式GH都需要首先同細胞表面特異性受體結合，即在生理激素濃度下，1分子GH與2分子GHR相結合從而導致受體二聚化［8］，再由GHR介導將信號傳入細胞內促進細胞的有絲分裂，加速細胞的增殖，使內膜組織增生［9－10］。

正常情況下子宮內膜在雌孕激素作用下有很強的再生能力，只要內膜基底層不受損傷，或者受損的基底層沒有完全形成粗糙面，受損部位的內膜能夠很快再生而修復。IUA患者的子宮內膜基底層嚴重受損，無法再生修復，宮腔部分或全部閉塞，約90%由過度刮宮引起。通過查閱以往的研究［5］，GH研究主要偏于臨床，尚缺乏基礎研究的證據。本實驗同樣是在有過宮腔操作史造成子宮內膜受損和血液中GH水平無差異的條件下，研究組GHR表達水平明顯低于對照組，并且這種表達在子宮內膜腺體中的表達較多，而在子宮內膜間質中的表達較少。這表明GH有可能是通過促進子宮內膜腺體的增生和發育以增強子宮內膜的厚度和容受性，從而為IUA患者TCRA術后加用GH提供了理論依據，也為臨床應用GH治療IVF-ET中對反應不良性子宮內膜和子宮內膜反應不良性閉經提供了實驗證據。但是如果子宮內膜腺體中GHR不足、缺乏或變異，單方面提高GH水平并不能提高子宮內膜的厚度及容受性，相反超生理劑量的GH對GHR有反向調節作用［11］，過量的GH將會阻止了受體二聚化和信息傳遞甚至可能會增加患子宮內膜癌的風險［12］。

綜上所述，研究組GHR表達水平低于對照組，可能是由于研究組患者子宮內膜組織中的GHR水平較低從而使受損的子宮內膜難以修復或異常修復；并且GHR蛋白的陽性表達在子宮內膜腺體中較多，而在子宮內膜間質中表達較少，這表明GH主要是通過與子宮內膜腺體中的GHR結合以促進腺體的增生和發育，達到促進子宮內膜增生和發育的作用。因此臨床使用GH治療IUA時，要充分考慮到GHR的數量，可以探索使用其激素受體激動劑提高受體的數量，來調整藥物在IUA治療過程中使用的劑量，制定符合患者病情的個體化綜合治療方案，本實驗因收集樣本時間較短，樣本數量較少，今后需擴大更多的樣本量作進一步研究。

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Expression and significance of growth hormone receptor in the endometrial tissue of intrauterine adhesion patients

Ren Juan，Wei Bing，Song Enxue，et al
（Dept of Gynecology and Obstetrics，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo investigate the growth hormone receptor（GHR）expression and significance of endometrial tissue in patients with intrauterine adhesions.MethodsImmunohistochemistry MaxVision twostep and quantitative real-time PCR（qRT-PCR）were used to detect the expression of GHR protein and GHR mRNA IUA in patients endometrial tissue of IUA group（study group）and non IUA group（control group）.ResultsUsing immunohistochemistry assay to detect GHR protein expression and qRT-PCR to detect the GHR mRNA expression，and the differences between the study group and the control group were statistically significant（P＜0.05）.Immunohistochemistry was used to detect the expression of GHR protein in endometrial glands and endometrial stromal，the difference between the two parts were statistically significant（P＜0.05）.ConclusionThe expression of GHR in endometrial tissue in patients with IUA is lower than those of non-IUA，and this expression is more in endometrial glands，less in endometrial stroma，which provide a theoretical reference for the use of hormone in IUA patients after transcervical resection of adhesions（TCRA）.

intrauterine adhesions；growth hormone；growth hormone receptor

R 711.74

A

1000－1492（2015）07－1004－04

2015－03－20接收

國家自然科學基金青年科學基金項目（編號：81100412）

安徽醫科大學第二附屬醫院婦產科，合肥 230601

任 娟，女，碩士研究生；衛 兵，男，主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：weibing1965＠hotmail.com