阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長因子－1和Caspase－3蛋白表達的情況觀察

王 璇，吳成吉，董淑欣，王志群

（佳木斯大學附屬第一醫院神經四科，黑龍江佳木斯154000）

阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長因子－1和Caspase－3蛋白表達的情況觀察

王 璇，吳成吉，董淑欣，王志群＊

（佳木斯大學附屬第一醫院神經四科，黑龍江佳木斯154000）

目的 觀察阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長因子－1和caspase－3蛋白表達情況。方法 90只體重范圍在（240±10g）的健康Wister大鼠，隨機分為三組：觀察組（β—淀粉蛋白建模大鼠）、對照組（生理鹽水對照）和正常組，每組30只。用放射免疫法測定各組大鼠腦組織中的胰島素樣生長因子－1（IGF－1），western blot法檢測各組Caspase－3蛋白的表達情況。結果 觀察組、對照組和正常組腦組織中IGF－1蛋白表達水平分別為［（0.87±0.14）μIU／ml、（2.59±0.27）μIU／ml、（2.67±0.24）μIU／ml］，對照組、正常組的實驗結果與觀察組相比差異顯著（P＜0.05）；觀察組、對照組和正常組大鼠腦組織中caspase－3蛋白表達水平分別為［（69.72±11.39）μIU／ml，（31.22± 6.98）μIU／ml，（32.53±7.26）μIU／ml］，對照組和正常組的實驗結果與觀察組相比具有顯著差異（P＜0.05）。結論阿爾茨海默病模型大鼠腦組織中的IGF－1蛋白表達減少，Caspase－3蛋白表達增加；IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達在阿爾茨海默病大鼠中呈負相關。

阿爾茨海默病；Aβ1－40；IGF－1；caspase－3

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0874）

阿爾茨海默病是一種以大腦皮質和海馬區出現老年斑，神經原纖維纏結，神經元細胞突觸損傷或消失，神經組織中異常的炎癥和氧化應激反應為特點，造成患者進行性認知障礙的中樞神經系統退行性疾病［1］。Bassil研究發現阿爾茨、海默病的發生與Aβ的異常堆積密切相關，細胞周期相關細胞因子異常表達，引起神經元的損傷和丟失，導致患者的認知功能進行性減退［2］。本次實驗著重研究阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長因子－1和Caspase－3蛋白的表達情況，以從分子水平研究阿爾茨海默病的發病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由佳木斯大學動物實驗室提供的90只體重范圍在（240±10g）日齡45d的正常的Wister大鼠，隨機分為3組，每組30只，分別為觀察組、對照組和正常組。

1.2 方法

1.2.1 建模方法［3］無菌條件下，各組大鼠經腹腔注射10%水合氯醛麻醉。觀察組海馬內注射凝聚態Aβ1－40 4μl，針頭停留3min后緩慢撤針，封閉進針口防止溶液彌出，縫合傷口并局部使用抗生素防止感染；對照組向海馬內緩緩注入4μl生理鹽水，其他操作均與觀察組相同；正常組大鼠不做任何處理。各組大鼠均在正常條件下培養。

1.2.2 評價認知和學習能力［5］Morris水迷宮實驗是一種通過檢測大鼠的空間感和方向感來評價大鼠的學習記憶能力的實驗。水迷宮根據東南西北分為1，2，3，4四個象限，安全平臺隨機固定于某一象限的某個位置，水面超過安全平臺1cm，水溫在20－22℃范圍內，一共實驗5天。每天分別將大鼠從四個不同入水點面對池壁置入水中，記錄其找到安全平臺的時間（潛伏期）。若其在2min內找不到安全平臺，則人為牽引至安全平臺，在平臺上停留20s再放回籠中，此時潛伏期計作120s。取平均值。水迷宮實驗5d后進行跳臺實驗。跳臺實驗是通過檢測大鼠對電擊的反應來評價大鼠的學習記憶能力的實驗。將大鼠置入反應箱中5min熟悉環境后接通電擊電源，大鼠正常情況下會條件反射的尋找安全跳臺以躲避電擊。通過記錄大鼠首次跳上安全跳臺的時間（反應時間）和在5min內從跳臺上錯誤跳下的次數（基礎錯誤次數）；24h后重復操作，記錄第一次跳下跳臺的時間（潛伏期）和5min內錯誤跳下的次數（錯誤次數）作為評級其學習記憶能力的指標。

1.2.3 實驗方法 造模成功后，正常培養各組大鼠5天，在無菌條件下將各組小鼠斷頭取腦，一部分腦組織制成腦勻漿，用免放法檢測腦勻漿中IGF－1蛋白表達情況；另一部分腦組織在RIPA蛋白裂解液中提取總蛋白，用免疫印跡法檢測Caspase－3蛋白的表達情況。

1.3 統計學方法 采用SPSS 16.5軟件對所有實驗所得數據進行處理，對計數資料用χ2檢驗，對計量資料用t檢驗；并進行線性相關性分析。

2 結果

2.1 大鼠的行為學改變 Morris水迷宮實驗結果，觀察組、對照組和正常組的潛伏期分別為39.89 s、11.06s、10.23s；觀察組的潛伏期明顯長于正常組和對照組，差異顯著（P＜0.05）；正常組和鹽水組的差別較小，不具有統計學意義（P＞0.05）。跳臺實驗結果，觀察組較正常組和對照組相比，反應時間延長，基礎錯誤次數增多，潛伏期短，錯誤次數多，有顯著差異；正常組和鹽水組的差別較小，不具有統計學意義（表1）。

表1 跳臺實驗結果

2.2 IGF－1蛋白表達結果 觀察組、對照組和正常組的IGF－1蛋白表達水平分別為（0.87±0.14）μIU／L、（2.67±0.24）μIU／L、（2.59±0.27）μIU／L。觀察組與正常組和對照組相比，腦勻漿中的IGF－1蛋白表達水平明顯減少，差異顯著（P＜0.01）；正常組和鹽水組相比，差異較小（P＞0.05）。

2.3 Caspase－3蛋白表達結果 觀察組、對照組和正常組中Caspase－3蛋白表達水平分別為（69.72± 11.39）μg／ml、（31.22±6.98）μg／ml、（32.53± 7.26）μg／ml。觀察組與正常組和對照組組相比，腦組織中Caspase－3蛋白表達明顯增多，差異顯著（P＜0.01）；正常組和鹽水組相比，差異較小（P＞0.05）。

2.4 IGF－1蛋白表達和Caspase－3蛋白的相關性利用Spearman相關性分析對IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達的相關性進行檢驗，結果發現，觀察組IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達呈負相關（r＝－0.52，P＜0.01）。

3 討論

阿爾茨海默病是一種常見于老年人的，以大腦皮層和海馬區出現異常的老年斑，神經突觸的破壞，神經原纖維的纏結，神經元的壞死和丟失為特點的中樞神經系統退行性疾病造成患者的進行性認知障礙，學習能力和記憶能力下降。然而阿爾茨海默病的發生機制并不十分明確，普遍接受的觀點認為其可能與凋亡性細胞因子的過度活化有關。研究表明，阿爾茨海默病的發病主要與神經元當中的β－淀粉蛋白的異常表達有關，促進凋亡性細胞周期相關細胞因子的表達，導致神經組織的炎癥反應和氧化應激反應，造成神經細胞的損傷和死亡［6］。本次實驗通過觀察β－淀粉蛋白誘導的阿爾茨海默病大鼠模型腦組織中的IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白的表達的變化，有助于揭示阿爾茨海默病的發病機制，有利于尋找臨床治療阿爾茨海默病的有效方法。

β－淀粉蛋白有神經毒性，其在神經組織中的異常堆積可以造成以影響神經突觸延長，減少神經細胞間的成網，神經細胞遷移能減弱為特征的神經細胞結構和功能的損傷，Chommanart的研究表明，β－淀粉蛋白誘導的大鼠模型可以較好的模擬阿爾茨海默病的發病過程［7］。因此本次實驗使用的造模方法產生的實驗結果對阿爾茨海默病有較好的還原性。

IGF－1蛋白是一種調控神經干細胞增殖分化，神經細胞的能量代謝，突觸的延長，神經組織的修復，廣泛參與神經系統的許多功能調節，具有調節學習和記憶功能的細胞因子，并且其表達水平隨年齡的增加而減少［8］。所以IGF－1蛋白的異常降低可能與阿爾茨海默病的發病有關［9］。本次實驗中觀察組大鼠腦組織中的IGF－1蛋白表達水平與其他兩組相比下降，大鼠的學習記憶能力下降，這提示IGF－1蛋白表達水平下降會促進阿爾茨海默病的發生。

Caspase－3蛋白一種重要的細胞凋亡蛋白，可以通過級聯反應介導細胞的凋亡［10］。Caspase－3蛋白的異常活化與神經細胞的凋亡有關。本次實驗中觀察到，觀察組大鼠腦組織中Caspase－3蛋白表達相對于其他兩組增多，這提示該蛋白在腦組織中的表達增加會加重大鼠腦組織神經細胞的凋亡，造成大鼠的神經功能異常，學習記憶認知能力下降，與阿爾茨海默病的發生密切相關。

通過對阿爾茨海默病大鼠模型的IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達水平的觀察可以進一步揭示AD的發病機制，為AD的治療提供新的方向，有利于從基因水平和分子水平研究AD的有效治療途徑。

綜上，阿爾茨海默病大鼠模型中胰島素樣生長因子－1蛋白表達下降，Caspase－3蛋白表達增加；IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表達呈負相關。

［1］Munetsugu Hara，Yoshihiro Nishi，Yushiro Yamashita，et al.Relation between circulating levels of GH，IGF－1，ghrelin and somatic growth in Rett syndrome［J］.Brain and Development，2013，11（15）：1469.

［2］Fares Bassil，Pierre－Olivier Fernagut，Erwan Bezard，et al.Insulin，IGF－1and GLP－1signaling in neurodegenerative disorders：Targets for disease modification［J］.Progress in Neurobiology，2014，5（3）：346.

［3］何玉梅，邢 影，劉俊孚，等.CRP聯合IL－6檢測在輕度認知功能障礙患者血清中的變化及臨床意義［J］.中國實驗診斷學，2012，16（7）：1307.

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［5］Gurupadaswamy HD，Thirusangu P，Vijay Avin BR，et al.DAO－9（2，5－di（4－aryloylaryloxymethyl）－1，3，4－oxadiazole）exhibits p53 induced apoptogenesis through caspase－3mediated endonuclease activity in murine carcinoma［J］.Biomedicine ＆Pharmacotherapy，2014，6（8）：390.

［6］朱清遠，王玉發，顧加祥，等.hIGF－1轉基因促周圍神經再生和抑制肌肉萎縮的實驗研究［J］.中國實驗診斷學，2010，14（6）：808.

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［8］王瑛堅，石 磊，潘 穎，等.多囊卵巢綜合征患者血清抑制素B、類胰島素樣生長因子－I的測定及臨床意義［J］.中國實驗診斷學，2010，14（7）：1100.

［9］Kang HJ，Kim JH，Chung SJ.Homogeneous detection of caspase－3using intrinsic fluorescence resonance energy transfer（iFRET）［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，13（2）：1300.

［10］劉 暢，國海東，康湘萍，等.星形膠質細胞產生的趨化因子在阿爾茨海默病發生發展中的作用［J］.生理科學進展，2014，2（5）：125.

Observation of Alzheimer＇s disease model rats of insulin like growth factor－1 and Caspase－3 protein expression

WANG Xuan，WU Cheng－ji，DONG Shu－xin，et al.（First Affiliated Hospital of Jiamusi University Department of Neurology，Jia Mu－si 154000，China）

Objective To observe the change of insulin like growth factor－1and Caspase－3protein expression in Alzheimer＇s disease model rats.Methods 90Wister rats，weight in the range of（240±10g）with normal cognitive function，were randomly divided into three groups，named as the normal group；the control group（normal saline control group（observation group）；Alzheimer＇s disease model rats）.Determination of brain tissues of insulin like growth factor－1with radioimmunoassay（IGF－1），the expression of caspase－3protein by Western blotting.Results the IGF－in the brain tissue of model group rats 1protein expression is lower than the normal group；the observation group in brain tissues of rats with Caspase－3protein expression increased significantly.Comparison between groups with significant difference（P＜0.05）.Conclusion expression of IGF－1protein decreased in the model of brain tissue of Alzheimer＇s disease rats，expression of IGF－1protein was increased.IGF－1protein and IGF－1protein play roles in the development of Alzheimer＇s disease.

Blzheimer＇s disease；Aβ1－40；IGF－1；caspase－3

R749

A

王璇（1973－），副主任醫師，碩士。研究方向：腦血管病發病機制及治療。

2014－08－17）

1007－4287（2015）06－0874－03

黑龍江省青年科學基金項目（QC2011C053）

＊通訊作者