過表達TROP2對細胞增殖及遷移能力的影響

崔 倪，李 明，倪勁松，宋 軍

（1.吉林大學臨床醫學院，吉林長春130021；2.吉林大學第一醫院二部病理科，吉林長春130041；3.吉林大學中日聯誼醫院電診科，吉林長春130033）

過表達TROP2對細胞增殖及遷移能力的影響

崔 倪1，李 明2，倪勁松2，宋 軍3＊

（1.吉林大學臨床醫學院，吉林長春130021；2.吉林大學第一醫院二部病理科，吉林長春130041；3.吉林大學中日聯誼醫院電診科，吉林長春130033）

目的 探討過表達腫瘤相關鈣信號轉導因子2（TROP2）對細胞增殖及遷移的影響，為闡明腫瘤的發生機制提供新的途徑。方法 構建TROP2真核表達載體pcDNA3－TROP2；采用脂質體法將pcDNA3－TROP2轉染入人正常肝細胞LO2中，并通過G418壓力篩選獲得穩定表達TROP2的細胞株，之后通過MTT法檢測細胞的活力，通過劃痕法檢測細胞的遷移能力。結果 成功獲得了過表達TROP2的細胞株；進一步的研究結果顯示，過表達TROP2可增強細胞的活力和遷移能力。結論 過表達TROP2可促進腫瘤的發生，此結果為闡明腫瘤發生機制及腫瘤治療提供了新的途徑。

TROP2；腫瘤發生；增殖；遷移

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0879）

腫瘤相關鈣信號轉導因子2（Tumor－associated calcium signal transducer2，TROP2）基因于1995年首次被克隆。該基因位于人類1號染色體短臂D1S2890和D1S2801之間一個長約2.6cm的區域上，cDNA全長972bp，編碼一個含323個氨基酸、35.7kDa的跨膜糖蛋白。此蛋白帶有四個潛在的從基因組序列中預測出的N連接糖基化位點，其疏水的氨基酸分布具有I型膜蛋白特征，如類EGF重復以及與IL－2受體的序列同源［1，2］。并且它包含一個上皮生長因子樣的重復區、一個甲狀腺球蛋白樣重復區，其分子羥基端含有潛在的絲氨酸和酪氨酸磷酸化位點和一個磷脂酰基－肌醇結合共有序列［3］。TROP2在人體正常組織及體細胞成熟組織中很少表達，甚至幾乎沒有表達。但研究發現，TROP2在結腸癌、結腸直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鱗狀上皮細胞癌以及食管鱗狀細胞癌等多種類型的人類惡性腫瘤組織中均高表達［4－8］。由此我們推測，TROP2是一種新的原癌基因，與多種腫瘤的發生發展具有密切的相關性。本論文主要通過在正常細胞內過表達TROP2來研究它在腫瘤發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人正常肝細胞L02購自上海細胞庫。

1.2 重組質粒的構建 用Trizol法提取HepG2總RNA，并將mRNA逆轉錄為cDNA，之后用TROP2特異性引物通過PCR方法擴增TROP2的編碼序列，TROP2的正向引物：5’－GGAATTCATGGCTCGGGGCCCCGGCCTCGC－3’；逆向引物：5’－GCTCTAGAGGGTACCTACAAGCTCGGTTCCTTTC－3’。將PCR產物用EcoRI和XbaI酶切后連接入pcDNA3中，構建pcDNA3－TROP2。

1.3 細胞培養及轉染 LO2細胞分別在含10%新生胎牛血清的DMEM培養基中培養，并加入青霉素（100U／ml）和鏈霉素（100U／ml），培養條件為5%CO2，37℃。在6孔板中，每孔接種6×105個細胞，培養至細胞密度達到70－90%，以一孔細胞為例，吸凈細胞上清液，D－Hank’s清洗，換用無血清及無雙抗的DMEM培養液，將10μl Gene Trans滴入250μl無血清及無雙抗的DMEM培養液中，混勻，室溫靜置5min，再將9μg質粒滴入無血清及無雙抗的DMEM培養液中，混勻，將質粒－DMEM混合液逐步滴入Gene Trans－DMEM混合液中，混勻，室溫靜置20min，然后滴加在含完全培養基的細胞上清中，繼續培養4h后，改用含雙抗及含10%新生胎牛血清的DMEM培養基繼續培養24－48h。

1.4 構建TROP2過表達的LO2穩轉細胞系 LO2細胞用含10%FBS的DMEM培養基于37℃，5% CO2條件下培養。轉染前24h以每孔1×106個細胞接種于6孔板，每孔2ml。轉染時細胞密度達到80%左右。按照Gene Trans說明書將pcDNA3及pcDNA3－TROP2質粒分別轉入LO2細胞。轉染48h后，用500μg／ml濃度的G418持續篩選2周左右，挑取單克隆細胞株擴大培養，獲得穩轉細胞系。

1.5 Western blot 提前24h將細胞鋪于6孔板，至提蛋白時細胞處于對數生長期。PBS洗滌細胞，5 000rpm，離心5min，重復3次，每孔（6孔板）加入200μl裂解液，冰上30min，每隔5min渦旋振蕩一次，以使細胞充分裂解。12 000rpm離心10min后，將上清移入EP管，加入4×上樣buffer，煮樣10 min，使蛋白變性。取樣品上樣，電泳。配制轉膜緩沖液并于4℃預冷。將PVDF膜用甲醇浸泡40sec，取出后浸泡于轉膜緩沖液中備用。將方盤中放入轉膜緩沖液，在液面下進行轉膜裝置的安裝。并將轉膜裝置放入電泳槽中，倒入轉膜緩沖液，100V轉膜2h后取出PVDF膜，將膜標記正反面及電泳方向。用TBST（0.2%的Tween20）洗滌PVDF膜5min 2次，再用5%的脫脂奶粉4℃封閉過夜。之后用TBST（0.2%的Tween20）快速沖洗2遍，再洗滌15 min 1次，5min 4次（洗膜時均放于搖床上，以下同）。將用TBST稀釋后的一抗與PVDF膜一同裝入雜交袋中，放于搖床室溫4h。取出PVDF膜，用TBST（0.2%的Tween20）快速沖洗2遍，再洗滌15 min 1次，5min 4次。將用TBST稀釋后的二抗與PVDF膜一同裝入雜交袋中，放于搖床室溫2h。取出PVDF膜，用TBST（0.2%的Tween20）快速沖洗2遍，再洗滌15min 1次，10min 4次。將PVDF膜拿入暗室，ECL顯影。

1.6 MTT 0.25%胰酶消化各實驗組細胞后，用含10%FBS的DMEM培養基配成單細胞懸液，以每孔1×103個細胞鋪于96孔板，每孔體積200μl，每種細胞設3個平行孔，共鋪8塊板。將培養板移入37℃，5%CO2孵育箱中培養，每隔24h取出1塊板，每孔加入MTT溶液（5mg／ml）20μl，37℃繼續培養4h。小心吸棄孔內的液體，每孔加入200μl DMSO，振蕩10min，使結晶物溶解。選擇OD570，使用酶標儀測定各孔的光吸收值。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制曲線。

1.7 細胞運動實驗 0.25%胰酶消化各實驗組細胞后，用含10%FBS的DMEM培養基配成單細胞懸液，以每孔1×106個細胞鋪于6孔板，每孔2ml，每種細胞設2個平行孔。24h后，細胞基本鋪滿整個孔，用大槍頭刮細胞表面，出現大約5mm寬的劃痕區。將各培養孔中培養基用新鮮的無血清培養基替換后繼續培養，以防止劃落的細胞重新落入劃痕區。繼續培養24－48h后觀察，并每隔24h拍照一次進行記錄。

1.8 統計學分析 采用卡方檢驗對實驗數據進行分析，P＜0.05表示統計學差異顯著，P＜0.01表示統計學差異非常顯著。所有數據均用SPSS10.0軟件統計分析。

2 結果

2.1 過表達TROP2穩轉細胞株的建立及鑒定為了研究TROP2基因的功能，本研究將pcDNA3－TROP2重組質粒轉入LO2細胞，同時以轉染pcDNA3質粒的LO2細胞做對照。將兩種轉染細胞用G418持續篩選2周，挑取單克隆細胞株擴大培養，從而獲得過表達TROP2的LO2穩轉細胞株。提取胞漿蛋白，之后進行Western blot，檢測細胞中TROP2的表達。結果顯示，在pcDNA3－TROP2穩轉細胞中，與pcDNA3穩轉細胞及未轉染的LO2細胞相比，TROP2蛋白表達水平顯著升高（圖1），說明已成功建立了TROP2穩定表達細胞株。

圖1 Western blot方法鑒定穩轉細胞中TROP2的表達

2.2 過表達TROP2對細胞體外增殖能力的影響分別將轉染pcDNA3、pcDNA3－TROP2質粒的LO2細胞以相同密度（1×103個／孔）鋪于96孔板，進行MTT檢測，以分析各組細胞的體外增殖能力。實驗結果如圖2所示，從第3天開始，轉染pcDNA3－TROP2質粒的細胞比轉染pcDNA3質粒的細胞活力明顯增高（P＜0.05），提示過表達TROP2后可以顯著增強LO2細胞的體外增殖能力。

2.3 過表達TROP2對細胞運動能力的影響 以每孔1×106個細胞的密度將兩組細胞分別鋪于6孔板，24h后細胞基本鋪滿整個孔，然后用大槍頭刮細胞表面，出現一道約5mm的劃痕區，換成新鮮的無血清培養基培養，24h及48h分別在顯微鏡下觀察劃痕區的寬度并進行拍照記錄。實驗結果如圖3所示，轉染pcDNA3－TROP2質粒的細胞劃痕區寬度明顯比轉染pcDNA3質粒的細胞變窄。這說明過表達TROP2的LO2細胞運動能力明顯增強。

圖2 過表達TROP2對細胞活力的影響

圖3 細胞劃痕試驗檢測細胞的運動能力

3 討論

惡性腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的一類疾病，其發病率和死亡率逐年上升，而惡性腫瘤難以根治的一個重要原因就在于目前針對腫瘤發生的具體機制還不是十分清楚。現有研究表明，腫瘤是由多因素引起、多基因參與并經歷了多階段的演變過程，其中原癌基因的活化在腫瘤發生發展的過程中起著重要作用。人類滋養層細胞表面抗原（TROP2）基因，即腫瘤相關鈣信號轉導因子2，是1995年首次被克隆出來的新基因［1，2］。研究發現，TROP2在人體正常組織及體細胞成熟組織中很少表達，甚至幾乎沒有表達，但是卻發現它在結腸癌、直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、口腔鱗狀上皮細胞癌以及食管鱗狀細胞癌等多種類型的人類惡性腫瘤中均高表達［4－8］。因此推測TROP2是一種新的原癌基因，并與多種腫瘤具有密切的相關性。但是對TROP2基因的功能和它在腫瘤發生發展中的作用以及如何引起腫瘤發生的機制等方面的研究還不是十分清楚。本文在正常細胞中過表達TROP2后，發現正常細胞有惡性轉化的現象，表明TROP2在腫瘤的發生發展中起著重要的作用。

為了確切研究TROP2基因的結構與功能，以及它在腫瘤發生發展中的作用，本文采用了基因轉染的方法，這是目前應用最多、技術最成熟的研究基因功能的方法之一。此方法是將目的基因轉入某一細胞后，通過不同檢測手段及觀察該細胞生物學行為的變化，從而了解該基因功能。因基因的表達受轉染效率和是否持續穩定表達兩方面因素的影響，所以本文又采用了穩定轉染的方法，即將pcDNA3－TROP2重組質粒轉入LO2細胞，并以轉染pcDNA3質粒和GFP質粒的細胞做對照，然后在G418選擇壓力下持續篩選2周，從而獲得過表達TROP2的穩轉細胞株。之后，采用Western Blot方法從蛋白質水平來鑒定穩轉細胞株中TROP2的表達。

我們用MTT法分別檢測了轉染pcDNA3及pcDNA3－TROP2質粒的LO2細胞以及未轉染的LO2細胞的體外增殖能力，并繪制了連續8d的生長曲線，從圖14中我們可以看出過表達TROP2基因的細胞株的體外增殖能力明顯增強。說明TROP2在促細胞生長中發揮了重要作用。

正常細胞外粘著糖蛋白，可增強細胞與細胞外基質間的粘著。而癌細胞的纖粘連蛋白顯著減少或缺失，鈣粘蛋白合成發生障礙，從而破壞了細胞與基質之間和細胞與細胞之間的粘著，所以癌細胞與其同源正常組織細胞相比，細胞與細胞間、細胞與基底物間的粘著性明顯降低，在體內容易分散和轉移。對此我們采用細胞劃痕試驗對過表達TROP2細胞株的運動能力進行了分析。細胞劃痕法是借鑒體外細胞致傷愈合試驗模型，來測定腫瘤細胞在細胞外基質上的運動能力。我們研究發現，轉染pcDNA3－TROP2質粒的LO2細胞在24h內與對照組細胞的運動能力相比明顯增強，說明TROP2在促細胞轉移中發揮了重要作用。

綜上所述，本研究結果提示TROP2的過表達與腫瘤的發生、發展密切相關，從而為闡明腫瘤的發生機制以及腫瘤的治療提供了新的途徑。

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Effect of overexpression of TROP2 on cell proliferation and mobility

CUI Ni1，LI Ming2，NI Jin－song2，et al.（1.College of Clinical Medicine，Jilin University，Changchun130021，China；2.Department of Pathology，the First Hospital of Jilin University，Changchun130041，China）

Objective To investigate the effect of overexpression of tumor－associated calcium signal transducer2（TROP2）on cell proliferation and mobility.Methods Construction of TROP2expression vector pcDNA3－TROP2，and transfected it into human normal liver cell L02with Gene Trans，then screening of stable expression of TROP2cells by G418.we further investigate the cell viability by using MTT mathod and cell mobility by using scratch test.Results constructed TROP2－overexpression cell line successfully，further result revealed that overexpression of TROP2enhanced cell viability and mobility.Conclusion Overexpression of TROP2can promote tumorigenesis，these results provided a new target for clarifing mechanism of tumorigenesis and tumor therapy

TROP2；tumorigenesis；proliferation；mobility

R730.231

A

2014－09－15）

1007－4287（2015）06－0879－04

＊通訊作者