不同負荷游泳運動對老齡大鼠學習記憶能力及海馬神經Bcl－2、Bax的影響

鄭 妍，劉忠民，李 靜，王永良

（吉林大學體育學院，吉林長春130012）

不同負荷游泳運動對老齡大鼠學習記憶能力及海馬神經Bcl－2、Bax的影響

鄭 妍，劉忠民＊，李 靜，王永良

（吉林大學體育學院，吉林長春130012）

隨著人們年齡的逐漸增大，大腦會在組織形態學方面有所改變，更重要的是在其神經生化等方面也會隨著人年齡的增長而出現一系列的改變，這些改變會使其逐步走向衰老，這是自然界一種復雜的生命現象。在老齡化社會背景下，以認知機能退行為主要特征的腦老化問題十分突出，其進行性風險是老年性癡呆。海馬神經是執行認知機能的靶器官，是人體認知和學習記憶能力的控制中樞。人體衰老后，大腦也會逐漸老化，而此時腦海馬區也會發生相應的變化。運動干預延緩海馬神經的認知老化是目前防治認知退行性疾病的主流研究之一。

多數研究認為，通過運動可以逆轉海馬神經突觸數量減少［1］和突觸體膜流動性下降［2］，增加c－fos等基因的表達［3］，延緩腦老化的進程。然而運動方式干預海馬神經認知老化的具體效果與機制研究尚屬少見，仍然有待于進一步研究，究竟何種機制占主導也尚待實驗證明。因此，還需進一步提出假說及實驗驗證，尋求改善認知機能的相關的有力依據和不利影響，從而明晰其機制，為運動干預腦老化的深入研究奠定基礎，提供科學依據。

1 對象與方法

1.1 實驗動物與分組

16月齡的雄性wistar大鼠48只，生產許可證為SCXK（吉）－2013－0001，全部由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供。隨機平均分為對照組（無人為的運動負荷，常規飼養）、大負荷運動組（每天游泳60min）、中等負荷運動組（每天游泳30 min）、小負荷運動組（每天游泳15min）［35］。進行為期八周的游泳運動，在水溫30±1℃，在直徑為60cm，高80cm，水深70cm的圓形桶中進行。

1.2 八臂迷宮實驗

行為學測試采用八臂迷宮實驗，為期八周的運動干預實驗結束后，對各組大鼠進行禁食減重，減至體重的85%，讓大鼠產生饑餓感，這樣在行為學測試時，大鼠才有想要覓食的動力。體重達標后，進行適應性訓練，為期3天，每天1次。適應性訓練開始時在每個臂的盡頭處放置少量飼料，將老齡大鼠放置于八臂迷宮中央處，讓其自由選擇并吃食，每只大鼠適應5min后取出。

正式實驗共為期7天，隨機選擇4個臂放置食物；每只大鼠將4個臂食物吃盡后取出，即結束1次測試；如5min后臂中食物仍未吃完，則也將大鼠取出，即結束1次測試；測試期間進行全程實時監控。測試指標為：①完成時間：老齡大鼠吃完所有食物所用時間，如果到5min后食物仍有剩余，則停止測試，按照5min記錄時間；②工作記憶錯誤：老齡大鼠每重復進入已吃過食物的臂1次則為1次工作記憶錯誤，記錄每次測試時大鼠工作記憶錯誤次數。

每次測試時的實驗條件保持一致；每只大鼠測試完畢后，用酒精認真擦洗實驗器材，避免留下殘留氣味。

1.3 實驗取材及免疫組化染色測試

行為學測試結束后，對老齡大鼠進行解剖以備進行相關指標檢測。在運動干預實驗過程中，由于高齡、溺水等原因各組大鼠均出現死亡現象，在行為學測試后，每組大鼠剩余數為：大負荷運動組6只，中等負荷運動組7只，小負荷運動組8只，對照組10只，因此每組隨機抽取出6只老齡大鼠進行解剖以備進行相關指標檢測。

首先給大鼠注射鹽酸利多卡因注射液（5ml／只）將大鼠麻醉，隨后將大鼠固定在手術臺上；利用手術工具打開大鼠腹腔，并暴露大鼠的心臟，然后從大鼠心臟左心室尖處依次灌注0.9%的生理鹽水和4%的多聚甲醛固定液。固定后，將大鼠斷頭并取其海馬組織浸泡在10%中性福爾馬林固定液中，石蠟包埋切片，進行免疫組化染色時嚴格按照說明書要求由專業技術人員操作。

1.4 圖像分析與數據處理方法

八臂迷宮實驗數據使用SPSS13.0軟件進行統計，采用組間對比使用重復測量方差分析的方法，結果用平均數±標準差表示，P＜0.01表示非常顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＞0.05則表示沒有統計學差異。

免疫組化圖像分析采用正置顯微鏡，計數同一視野下陽性細胞數占總細胞數的百分比，數據使用SPSS13.0軟件進行統計，采用Student’s t－test方法，結果用平均數±標準差表示，P＜0.01表示非常顯著性差異，P＜0.05表示具有顯著性差異，P＞0.05則表示沒有統計學差異。

表1 對各組老齡大鼠運動干預后進行八臂迷宮實驗和海馬神經Bcl－2、Bax免疫組化檢測結果

2 結果

2.1 各組老齡大鼠進行八臂迷宮實驗的結果

本實驗中，老齡大鼠每次進行八臂迷宮實驗的結果（見表1）。完成時間，與對照組相比，小負荷運動組用時最少（P＜0.05）；大負荷運動組多于對照組（P＞0.05）；工作記憶錯誤次數，與對照組相比，小負荷運動組明顯減少（P＜0.05）；大負荷運動組出現錯誤次數最多（P＜0.05）；中等負荷運動組低與大負荷運動組（P＜0.05）。

2.2 不同負荷運動對老齡大鼠海馬神經Bcl－2、Bax表達

不同負荷運動組的各只老齡大鼠海馬神經Bcl－2的陽性細胞表達數占其同一視野下總細胞數的比值情況（見表1），免疫組化表達圖（見圖1）。Bcl－2的免疫反應的陽性細胞通過20×10倍的光鏡下可觀察到主要定位在神經元細胞的細胞漿和細胞膜，呈棕褐色顆粒。與對照組相比，小負荷運動組Bcl－2的表達最多（P＜0.01）；中等負荷組處于大負荷組與小負荷組之間，雖略高于對照組，但是二者之間沒有統計學差異（P＞0.05）；而大負荷運動組低于對照組（P＜0.01）。

不同負荷運動組的各只老齡大鼠海馬神經Bax的陽性細胞表達數占其同一視野下總細胞數的比值情況（見表1），免疫組化表達圖（見圖2）。Bax的免疫反應的陽性細胞通過20×10倍的光鏡下可觀察到主要定位在神經元細胞的細胞漿和細胞膜，呈棕褐色顆粒。與對照組相比，小負荷運動組海馬神經Bax的表達最少（P＜0.05）；中等負荷組處于大負荷組與小負荷組之間，雖略高于對照組，但是二者之間沒有統計學差異（P＞0.05）；而大負荷運動組表達顯著增多（P＜0.01）。

圖1 海馬神經Bcl－2表達情況

圖2 海馬神經Bax表達情況

3 討論

在為期8周的游泳訓練結束后，老齡大鼠進行八臂迷宮實驗，記錄各組老齡大鼠每次完成八臂迷宮實驗的時間，來表示其學習記憶的效果，從而體現其學習記憶能力的差異。完成時間越短，說明其學習記憶能力越強、學習速度越快；如完成時間越長，則說明其學習記憶能力下降。記錄各組老齡大鼠進行八臂迷宮實驗時的工作記憶錯誤次數，來表示其學習記憶的效果，從而體現其學習記憶能力的差異。工作記憶錯誤出現的次數越少，說明其學習記憶能力越強、學習速度越快；如工作記憶錯次數越多，則說明其學習記憶能力下降。本研究結果顯示：小負荷運動組完成時間最短，工作記憶錯誤次數最少，說明長期堅持適宜負荷的運動鍛煉有助于提高學習記憶能力。

進行適宜負荷的體育鍛煉對提高學習記憶能力是有促進作用的，其發生機制為：經常性的進行運動可以改善中樞神經系統的機能，使大鼠腦內紋狀體、海馬、前額葉皮層及伏隔核的DA代謝加強，使記憶的物質基礎發生變化，對發展智力起到促進的作用；與此同時，還可以通過逆轉突觸數量減少和突觸體膜流動性下降，提高大腦的工作效率，從而對延緩腦衰老起到重要作用。此外，堅持進行適宜的有氧運動，有助于加快人體的血液循環能力、并加快其氣體交換的能力，可以使全身的微細血管開放，這樣更充足的氧氣就可以供給給大腦，可以有效地改善大腦皮層神經活動過程的興奮性以及各中樞之間的協調性，這也將對學習記憶能力的提高起到促進作用［6］。

Bcl－2作為一種抗凋亡蛋白，對MPT（即線粒體通透性轉變孔，mitochondria permenbility transition pore）的開放具有一定的調節作用，其存在形式為細胞器（如線粒體，內質網和核膜）的整合膜蛋白；而Bax作為一種促凋亡蛋白，分布于細胞骨架上或者是胞漿中，形式為非活性。當死亡的信號刺激細胞后，促凋亡蛋白Bax就會出現構象的改變，由胞漿中轉至線粒體外膜，并與膜上的抗凋亡蛋白發生相互作用，使抗凋亡蛋白喪失對細胞凋亡的抑制作用，引起線粒體內各種促凋亡因子的釋放，最終導致細胞凋亡［7］。

人們在對人類和動物的認知功能進行研究時，通常將海馬視為經典區域并作為重點對象開展相關研究。目前已有部分研究指出，大鼠的海馬神經元的凋亡是造成其認知功能受到損害的主要原因［8，9］。本研究中，在進行8周的不同負荷運動后發現，老齡大鼠海馬神經Bcl－2和Bax的表達存在差異，多重比較后發現，小負荷運動組和中等負荷運動組Bcl－2的表達升高并伴隨Bax的表達降低，且小負荷運動組細胞凋亡現象發生甚微，大負荷運動組情況則相反。

運動訓練可以激發細胞凋亡的發生［10］，其凋亡程度主要取決于運動負荷量的多少，通過Bcl－2和Bax表達的多少可以反映出細胞凋亡的情況。進行8周的運動后，不同的運動負荷會給老齡大鼠帶來不同的刺激致使其海馬神經Bcl－2和Bax會出現不同的表達。其中小負荷運動組的大鼠其海馬神經Bcl－2表達最多，Bax表達最少，而大負荷運動組的結果正好與之相反，說明老齡大鼠進行小負荷運動可以有效抑制海馬神經細胞的凋亡，而長期的大負荷運動則會使其凋亡現象顯著增加。

通過研究發現，適宜的運動負荷可以對機體產生良性的影響。在一定的生理范圍內，運動對老齡大鼠的學習記憶能力及抑制海馬神經細胞凋亡起到促進的作用。

［1］洪 岸.老年大鼠學習記憶減退的神經過敏基礎［J］.生理科學進展，1995，26（3）：240.

［2］Wu A，Ying Z，Gomez－pinilla F.Docosahexaenoic acid dietary supplementation enhances the effects of exercise on synaptic plasticity and cognition［J］.Neuroscience，2008，155（3）：751.

［3］劉忠民，劉惠佳，宋 燕，等.不同運動負荷對大鼠海馬神經c－fos表達的影響［J］.中國實驗診斷學，2011，15（6）：963.

［4］徐 波，季 瀏，林龍年，等.游泳訓練對大鼠學習記憶和腦內神經遞質的影響［J］.中國運動醫學雜志，2004，23（3）：261.

［5］趙 峰，李建平.不同負荷的運動訓練對大鼠血漿ADM、ET含量變化的影響及意義［J］.北京體育大學學報，2005，28（5）：631.

［6］王芳媛.體育運動對老年癡呆癥的預防及運動處方的制定［J］.遼寧休育科技，2005，27（2）：42.

［7］Gross A，McDonnekk JM，Korsmeyer SJ.Bcl－2family members and the mitochondria in apoptosis［J］.Genes Dev，1993，13（15）：1899.

［8］胡旺平，李雪梅，胡圣望.慢性應激對大鼠空間學習、記憶和海馬一氧化氮的影響［J］.中國心理衛生雜志，2003，17：75.

［9］Lueassen PJ，Vollmann－Honsdorf GK，Gleisberg M，et al.Chronie Psyehosoeial stress differentially affeets apoptosis in hippoeampal subregions and cortex of the adult tree shrew［J］.Eur J Neurosci，2001，14：161.

［10］劉麗萍，等.游泳訓練后大鼠肝細胞SOD、MDA線粒體膜電位的變化與細胞凋亡［C］.第六屆科學大會論文集.

2014－10－17）

1007－4287（2015）06－0890－04

吉林省科技廳自然科學基金面上項目（項目編號201215037），吉林大學研究生創新基金資助項目（項目編號2014074）

＊通訊作者